分子光谱分析Chapter05

1、2021/8/141Ch 5. INSTRUMENTs山西大学 SHANXI UNIVERSITY 2021/8/142山西大学 SHANXI UNIVERSITY2021/8/1432021/8/1442021/8/145Ch02 仪器仪器1.光源光源入射和出射狭缝入射和出射狭缝2.光栅光栅-1滤光片或起偏器滤光片或起偏器参比参比PMT3.样品系统样品系统滤光片或检偏器滤光片或检偏器入射和出射狭缝入射和出射狭缝2.光栅光栅-24.检测器检测器2.1 基本组件基本组件2021/8/1461 - light source, 2 - exciting filter, 3 - fiber optic

2、al bundle, 4 - barrier filter, 5 - photodetector. Apparatus consists of a halogen lamp (75 W), 2 fiber optical bundles for transfer both exciting light to an object and fluorescence light to photodetector; photometric device, image analyser. 2021/8/1472021/8/1482.1.1 光源光源 传统的稳态光源传统的稳态光源2021/8/149202

3、1/8/1410253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5404.7435.8546.1577.0579.0表表2.1 汞灯的线光谱汞灯的线光谱(nm)2021/8/1411 氙灯氙灯的光强度较汞灯相对较低，但是可以提供连续光谱，的光强度较汞灯相对较低，但是可以提供连续光谱，而且在较宽波段内光强度的变化较小，而且在较宽波段内光强度的变化较小， 只是在紫外区只是在紫外区200-300nm范围的光强度较低。是目前最常用的光源。范围的光强度较低。是目前最常用的光源。 氙灯长时间氙灯长时间工作时，光输出强度会浮动，需要进行校正。氙灯的特征线可工作时，光输出强度会浮动，需要进

4、行校正。氙灯的特征线可用于校正单色器。用于校正单色器。 氙汞灯氙汞灯作为光源作为光源,即可提供较强的光强度，又可以提供连续即可提供较强的光强度，又可以提供连续光谱，然而在汞线波长下的光强度更强。光谱，然而在汞线波长下的光强度更强。 氘灯氘灯虽然也用作紫外光源，但是发射强度低得多，因此常虽然也用作紫外光源，但是发射强度低得多，因此常用在紫外可见分光光度计上作为光源。用在紫外可见分光光度计上作为光源。Time 脉冲光源和稳态光源输出特性比较脉冲光源和稳态光源输出特性比较2021/8/1412 脉冲光源（脉冲光源（Flashing Sources） 进行时间分辨分析或磷光测定时，需要脉冲光源。闪光灯

5、进行时间分辨分析或磷光测定时，需要脉冲光源。闪光灯和激光都可以作为脉冲光源。其中激光是最好的脉冲光源，如和激光都可以作为脉冲光源。其中激光是最好的脉冲光源，如可锁模的氩离子激光器发射的脉冲宽度为可锁模的氩离子激光器发射的脉冲宽度为100ps，重复频率可以，重复频率可以达到达到76MHz。 脉冲氙灯也可作为脉冲光源用于常规的荧光仪器中。脉冲氙灯也可作为脉冲光源用于常规的荧光仪器中。Perkin-Elmer公司和公司和Varrian公司的荧光光度计就采用了这种光公司的荧光光度计就采用了这种光源，后者的使用寿命达源，后者的使用寿命达20000小时。小时。ns级脉冲氙灯提供的脉冲宽级脉冲氙灯提供的脉冲

6、宽度在度在100ps- s范围，范围， s级脉冲氙灯可以提供宽度为级脉冲氙灯可以提供宽度为 s-ms-s的激的激发脉冲，能够满足磷光的时间分辨测量。发脉冲，能够满足磷光的时间分辨测量。2021/8/1413Solid-state light sources1. Light-emitting diodes(LEDs) are available which provide output over a wide range of wavelengths. LEDs are rather inexpensive. LEDs are solid-state devices which require

7、little power and generate little heat. LEDs can be placed close to the samples.2. Laser diodes emit monochromatic radiation. Laser diodes are available with wavelengths ranging from 630 to 1500 nm, even shorter wavelengths. Laser diodes are convenient because the output is easily focused and manipul

8、ated. 2021/8/1414 荧光计上配备有两个单色器，一个是激发单色器，一个荧光计上配备有两个单色器，一个是激发单色器，一个是发射单色器。因此可以记录激发和发射光谱。单色器由两是发射单色器。因此可以记录激发和发射光谱。单色器由两个狭缝，即入射狭缝和出射狭缝个狭缝，即入射狭缝和出射狭缝,和色散装置组成。色散装置和色散装置组成。色散装置多使用光栅，很少采用棱镜。多使用光栅，很少采用棱镜。 单色器输出的单色器输出的光强度与狭缝的宽度的平方成正比。光强度与狭缝的宽度的平方成正比。采用采用较宽的狭缝，光的强度较高，但是波长的分辨率较差；采用较宽的狭缝，光的强度较高，但是波长的分辨率较差；采用较窄

9、的狭缝，可以提高分辨率，但是要牺牲部分光强度。较窄的狭缝，可以提高分辨率，但是要牺牲部分光强度。Plane or concave grating2.1.2 MONOCHROMATORS2021/8/1415 与棱镜相比，使用光栅的优点是光栅在所有波长范围内与棱镜相比，使用光栅的优点是光栅在所有波长范围内有一致的分辨率，但也有不足之处，采用光栅会产生二次甚有一致的分辨率，但也有不足之处，采用光栅会产生二次甚至三次散射，当荧光比较弱时，这些高级次次的散射光就会至三次散射，当荧光比较弱时，这些高级次次的散射光就会被检测出来被检测出来 。2021/8/1416Incidentradiation300n

10、m, 1st order 600nm, 1st order300nm, 2nd order1st order2nd orderFirst- and second-order diffraction off a diffracting grating.The region where there is no overlap of the first- and second-order diffraction is called the free spectral range2021/8/14172021/8/14182.1.3 样品池样品池456045样品辐射方式样品辐射方式反射直角反射直角 3

11、0/60度度 透射直角透射直角1010mm cuvette/cell (Quartz or Glass)Flow cell2021/8/1419固体样品架固体样品架a. F4500荧光光度计固体样品架：荧光光度计固体样品架： 1.样品室，样品室，2. 弹簧，弹簧， 3. 固定螺丝固定螺丝b. 自行设计的用于自行设计的用于MPF4荧光仪的固体样品架，滤纸放置在荧光仪的固体样品架，滤纸放置在铜片做成的样品架上，样品架的位置由旁边套管上的铜柱固定铜片做成的样品架上，样品架的位置由旁边套管上的铜柱固定，而旋转筒磷光计的旋转筒就在铜套内。，而旋转筒磷光计的旋转筒就在铜套内。 2021/8/1420图图2

12、.17 磷光镜磷光镜a 圆筒式切光器圆筒式切光器 b 片式切光器片式切光器 1. 样品管样品管 2. 杜瓦瓶杜瓦瓶2021/8/1421磷光的低温测量磷光测量磷光测量-1hv石英管杜瓦瓶液氮hv固体表面室温磷光测量 准备基质材料微升或亚微升级点样，并干燥 磷光测量hvhv2021/8/1422 光电倍增管光电倍增管(photomultiplier Tube, PMT): RTP red-sensitive PMT, R928(mammadzu); Photon-count PMT 二极管阵列二极管阵列(diode-array detector, DAD) 电荷耦合器件电荷耦合器件(CCD,co

13、uple-charged device)2.1.4 Detectors 模拟型模拟型PMT: 模拟信号是光子流量的大小，取各个脉冲所贡献的平模拟信号是光子流量的大小，取各个脉冲所贡献的平均值，检测灵敏度或增益随着加到打拿极上的高压的大小而变化，电压均值，检测灵敏度或增益随着加到打拿极上的高压的大小而变化，电压增大增大100V，信号强度增强，信号强度增强3倍。因此要求高压电源非常稳定。在较强的发倍。因此要求高压电源非常稳定。在较强的发光信号测量中采用这种模式。光信号测量中采用这种模式。 光子计数光子计数PMT：对于很弱的发光，可以采用光子计数法测定。光子：对于很弱的发光，可以采用光子计数法测定。

14、光子计数是在理论极限灵敏度下计数是在理论极限灵敏度下检测和计数检测和计数每个光子引起的阳极脉冲，灵敏每个光子引起的阳极脉冲，灵敏度不受电压的影响。由于信号较弱，需要进行多次扫描取平均值。度不受电压的影响。由于信号较弱，需要进行多次扫描取平均值。2021/8/14232.1.5 常见的商品仪器常见的商品仪器 F-4500荧光磷光化荧光磷光化学发光分光光度计学发光分光光度计 Varrian Cary Eclipse 荧光光度计荧光光度计 P-E LS-55荧光荧光光度计光度计 相同档次的还有：相同档次的还有：美国美国Jobin-Yvon-Fluoromax-3 一体化荧光光度计一体化荧光光度计 2

15、021/8/1424Dual-channel ConfocalLifetime Imaging & FluorescenceCorrelation SpectroscopyImaging individual molecules to quantify their interactions. 样品样品 物镜物镜 激光激光 分光镜分光镜狭缝狭缝检测器检测器2021/8/1425Edinburgh Instrument 公司公司 FLS900系列荧光光度计系列荧光光度计具有很强的时间分辨测量的功能和极高的灵敏度，图具有很强的时间分辨测量的功能和极高的灵敏度，图2.17是该公司是该公司FLS920P荧光光度计。仪器的光源采用荧光光度计。仪器的光源采用ns闪光灯（闪光灯（450W氙弧光灯）氙弧光灯），能够提供，能够提供ns级级的脉冲，因此可以进行的脉冲，因此可以进行100ps-50s寿命荧光或磷光的时间分辨分析。仪器的寿命荧光或磷光的时间分辨分析。仪器的光谱分辨率为光谱分辨率为0.05nm，能够有效地消除散射光的干扰。检测器采用了单光，能够有效地消除散射光的干扰。检测器采用了单