神经通路示踪技术 尼式染色

1、神经组织的固定l （一）固定(fixation)l 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性。更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原防止抗原弥散。l （二）固定剂(fixative)l 醛类固定剂l 双功能交联剂，使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。常用的醛类固定剂有10%钙-福尔马林液，10%中性缓冲福尔马林液，4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸缓冲液，戊二醛(Glutaraldehyde)-甲醛液，

2、Bouins液等l 其它固定剂：l 酒精（alcohol） ：l 使蛋白质脱水而致不可逆性的凝固变性。对组织有固定、硬化兼脱水的作用l 醋酸（acetic acid）：l 对核蛋白有明显的沉淀作用，不能单独使用，常与酒精联合使用l 苦味酸（picric acid）：l 沉淀蛋白并溶解粘蛋白，使组织柔软。l 铬酸（chromic acid） ：l 强氧化剂，能沉淀所有蛋白。重铬酸钾是氧化剂，对蛋白和脂类有固定作用，尤其是脂类。对核蛋白有溶解作用。l 氯化汞（mercury chloride） ：l 沉淀各种蛋白。但必须脱汞l 锇酸（osmium tetroxide） ：l 强氧化剂。蛋白的固定作

3、用较好，不发生沉淀，组织几乎不收缩。但渗透力弱。l 丙酮（acetone）l （三）固定方法l 1.浸入法l 将组织浸泡在固定液内。l 2.灌注法l 此法适用于动物实验研究。常用的切片方法常用的切片方法l 常用的有石蜡切片法、冰冻切片法、恒冷箱切片法、振动切片法.l 石蜡切片石蜡切片(paraffin sectioning) l 本法是将已固定的组织块常规脱水处理后，放入熔化的石蜡中浸蜡，将组织包埋在石蜡中制成蜡块，再用石蜡切片机切片(一般片厚5-10m)，然后将切片贴于载玻片上。本法适用于一般染色方法。l 冰冻切片冰冻切片(freezing sectioning) l 本法是将已固定或未经固

4、定的组织块经保护处理后，用液态二氧化碳或半导体致冷装置迅速致冷冻结变硬，然后在冰冻切片机上切片。本法可不必经脱水包埋处理，甚至可不经固定处理，故对组织细胞内的脂类成分及酶的活性影响较少，而且方法简单，制片速度快，缺点是难以切出10m以下的薄切片。l 恒冷箱切片法恒冷箱切片法(cryostat sectioning)l 本法是在冰冻切片技术基础上发展起来的切片技术，其特点是将己固定或未经固定的组织块冷冻处理后，在低温恒冷箱中进行切片，由于切片机装在恒冷箱内，整个切片过程在低温环境下进行，故能更好地保存组织内各种活性物质，并可切出较薄切片，此法特别适用于细胞化学及免疫细胞化学研究。l 振动切片法振

5、动切片法(vibration sectioning) l 本法是用特殊的振动切片机进行切片，振动切片机的特点是其刀片进行横向切割运动， 故可切割新鲜未经冰冻，末经固定的组织，切片厚度可达10m。常用于免疫细胞化学、免疫电镜及电生理学脑厚片技术。l 5冷冻干燥切片(freezing drying sectioning)：将新鲜组织放入经液氮预冷（-160）的异戊烷中骤冷后，入真空内干燥，已干燥的组织块进行真空包埋后切片。其特点是细胞在骤冷的同时立即停止一切生物化学变化，可研究骤冷时细胞内的物质变化状况。l 6超薄切片(ultrathin sectioning)：通过固定、脱水、包埋、切片和染色等

6、步骤。固定分预固定和后固定。包埋剂多为环氧树脂。切片用醋酸铀及枸橼酸铅进行电子染色，在电子显微镜下观察。神经组织的一般染色方法神经组织的一般染色方法l 尼氏法（尼氏法（Nissl staining）l 尼氏体（Nissl body）也被称作“嗜色小体”或“虎斑小体”，其主要成份是核糖核酸（RNA）和蛋白质组成。在各种类型神经元中，尼氏体的形状、大小与分布均不相同。由于含有RNA，故易为某些碱性苯胺染料所染色（如甲苯胺蓝，焦油紫类，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及培花青等）。本法除可显示正常神经元形态，特别是其内含的尼氏体情况外，还可显示当神经元受到损害，引致的尼氏体消失，即染色质溶解（chrom

7、atolysis），可供病理或临床诊断和实验研究参考。l Nissl染色程序：染色程序：l 切片入0.1%尼氏液中染色5至10分钟l 蒸馏水洗去染液l 70%酒精分色 1分钟l 80%酒精 1-2分钟l 90%酒精 1-2分钟l 100%酒精 2分钟l 100%酒精 2分钟l 二甲苯 2分钟l 二甲苯 2分钟l 中性树胶封片l 苏木精伊红染色法苏木精伊红染色法( hematoxyiln eosin，HE ) l 本法是组织学最常用的染色方法，它可显示组织内各种细胞结构，HE染色在神经生物学研究中亦常采用，苏木精是阳离子染料，可将细胞核内的嗜碱性物染成蓝紫色，伊红是阴离子染料，可将细胞质和胶原纤

8、维等染成粉红色。l 步骤:l 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟;l 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟;l 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟l 100%的酒精去二甲苯5分钟;l 100%的酒精去二甲苯5分钟l 90%的酒精水化2分钟;l 80%的酒精水化1分钟;l 70%的酒精水化1分钟l 用蒸馏水洗; (以上步骤统称为脱蜡至水)l 05%的苏木精染色，室温510分钟；l 水洗；l 1%的盐酸酒精分色3060秒；l 水洗；l 流水促蓝；l 1%的伊红室温染色2-5分钟；l 水洗；l 70%的酒精分色3060秒；l 80%的酒精脱水1分钟；l 90%的酒精脱水1分钟；l 100%的酒精脱水2钟；l 100%的酒精脱水2钟；l

9、二甲苯透明5分钟；l 二甲苯透明5分钟；l 中性树胶封片。l 结果：l 1 细胞质染成红色l 2 细胞核染成蓝色l Weigert 氏髓鞘染色法氏髓鞘染色法l 有髓神经纤维的髓鞘主要组成成分是磷脂，如以铬盐或铁钒媒染使之与苏木精结合，再藉分色处理，就能着色清晰，并在中枢神经系统显示其分布状态。髓鞘染色除可用于显示神经纤维干、束外，更多用于中枢神经系统纤维束的追踪。因为，尚未髓鞘完全的纤维束（如婴儿皮质脊髓侧束），或髓化受到损害而产生溃变的纤维束，在与正常已髓化的纤维对比之下可以区别。用劳克坚牢蓝（Luxol fast blue）类染料染色也可显示髓鞘，操作时也较容易。但染色作用较慢，染色也较浅

10、。l 镀银法（镀银法（silver impregnation ）l 镀银法又名浸银法，是用硝酸银镀染神经元，一个多世纪以来，镀银法为神经形态学的发展作出了重大贡献，此法于上一世纪七十年代由意大利解剖学家Golgi创建，故称为Golgi氏法。到目前Golgi原法己有许多改良法，经Cox改良的Golgi-Cox法，可以较好地显示神经元胞体、突起各部形态，是多年来较受欢迎的方法之一。神经细胞化学性质显示方法神经细胞化学性质显示方法l 1组织化学方法组织化学方法l （1）显示脱氧核糖核酸的孚尔根反应法）显示脱氧核糖核酸的孚尔根反应法(Feugen reaction) 利用schiff试剂显示细胞内DN

11、A的经典方法，其基本原理是组织经盐酸水解后打开DNA分子中脱氧核糖和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出脱氧核糖核酸中的醛基，醛基与schiff试剂中的亚硫酸品红结合，而在核内呈红色反应沉淀物。 l （2）显示多糖的过碘酸）显示多糖的过碘酸-schiff反应法反应法(Periodic acid Schiff reaction)简称PAS法，是显示组织或细胞内多糖和粘多糖成分的常用方法，其原理是通过碘酸的氧化作用，打开糖分子内1，2-乙二醇中的碳-碳键或糖中的的氨基，烃氨基衍生物，形成2-醛基，这些醛基与schiff试剂中的亚硫酸品红反应，形成紫红色化合物。l （3）显示脂类的脂溶性染料法）显示脂类的

12、脂溶性染料法 显示脂类通常用易溶于脂类的染料，使之溶于组织或细胞内的脂滴内而显色. 常用的这类染料有: 苏丹III (Sudan III)，苏丹IV (Sudan IV)，苏丹黑B (Sudan black B)，油红O (oil red O)等。l （4）显示酶的酶细胞化学方法）显示酶的酶细胞化学方法 酶显示法是显示酶的活性而不是酶的本身，细胞内含有多种酶，每一种酶都可催化一定的化学反应。酶显示法的基本原理是具有酶活性的组织切片或涂片，在含有酶作用底物和捕获反应产物的捕捉剂的孵育液中，经一定pH及一定温度的孵育，底物被酶催化分解后形成的初级反应产物被捕捉剂捕捉，并在原位沉淀，形成有色的最终产

13、物。2免疫细胞化学方法免疫细胞化学方法l 免疫细胞化学方法免疫细胞化学方法(Immunocytochemistry)是应用免疫学原理，通过抗原与特异性标记抗体结合，从而显示细胞内的抗原或抗体成分。这种方法可以定位或示踪细胞内各种成分，包括各种蛋白质、多肽、部分类脂质和多糖以及细胞膜表面的膜抗原和受体等等。由于在组织细胞内进行的抗原抗体结合是不可见的，故需要在抗体上结合一定的可见的标记物质。l 免疫组织化学染色免疫组织化学染色 l SP法l 1）脱蜡、水化；（石蜡切片，冰冻切片免此步骤）l 2）PBS洗23次各5分钟；l 3）3%H2O2（甲醇）滴加在切片上，室温静置20分钟；l 4）PBS洗2

14、3次各5分钟； l 5）抗原修复；（石蜡切片，冰冻切片免免此步骤）l 6）PBS洗23次各5分钟；l 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。l 8）滴加抗50l，室温静置1小时或者4过夜或者371小时。l 9）4过夜后需在37复温45分钟。l 10）PBS洗3次各5分钟；l 11）滴加抗4050l，室温静置，或371小时；l 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。l 13）PBS洗3次各5分钟；l 14）抗30分钟；l 15）PBS洗3次各5分钟；l 16）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；l 17）PBS或自来水冲洗10分钟；l 18）苏木精复染2分

15、钟，盐酸酒精分化；l 19）自来水冲洗1015分钟；l 20）脱水、透明、封片、镜检。 3荧光免疫细胞化学荧光免疫细胞化学l荧光免疫细胞化学荧光免疫细胞化学( immunofluorescent cytochemistry)的基本原理是用荧光染料作为标记物，标记上己知的抗原或抗体，再用标记上荧光素的抗体或抗原作探针，检测细胞或组织内的相应抗原或抗体。当荧光素结合的抗体与被检抗原或抗体结合，便可用荧光显微镜检测到这此抗原或抗体的定位。4免疫细胞化学的双重标记（免疫细胞化学的双重标记（Double staining）l 这一技术目的是在同一神经细胞胞体或它的突起内同时显示共存的两种或两种以上物质以

16、研究这些物质在同一神经元或它的突起内的共存现像，或含有不同化学物质的两种结构的相互关系。 5荧光细胞化学双标记法荧光细胞化学双标记法l 荧光细胞化学双标记法的原理亦如免疫细胞化学双标记方法，只是第二抗体标记物是不同的荧光素，如呈黄绿色荧光的FITC及呈红色荧光的TRITC，可将两种不同的特异性一抗混合与切片进行孵育，但两种一抗必须来自不同种动物。然后再与标记不同荧光素的两种针对第一抗体的二抗混合孵育，使各自与一抗结合。最后在荧光显微镜下用不同的激发滤片观察到两种不同反应产物的不同的荧光。6免疫电镜技术免疫电镜技术l 免疫电镜技术（immunoelectron microscope techni

17、que）是免疫细胞化学与电子显微技术结合的产物，用以在超微结构水平进行免疫细胞化学研究。 l 此技术的关键问题是标记物质必须是能满足电镜显微技术要求的电子致密物质，目前常用的为HRP、细胞色素C，近年来随着胶体金、纳米金技术的发展，更广泛的被采用作为免疫电镜的标记物。 神经胶质细胞的显示方法神经胶质细胞的显示方法l 过去长期以来用以显示神经胶质细胞的方法是基于Cajal镀银方法，其原理与神经细胞镀银方法相同，但效果不理想。后来镀银方法几经改进，效果有所改善。l 由于免疫细胞化学的应用及进展，目前已利用针对特定神经胶质含有的特异性化学成分的抗体准确的显示特定神经胶质的数目及形态细节。如由于星形胶

18、质细胞特异地含有胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP），小突胶质细胞表达半乳糖脑苷脂，小胶质细胞含有植物凝集素BS-1，可以应用针对各该物质的免疫细胞化学方法，显示各类胶质细胞并得到理想的结果。立体定位技术l在动物实验中，有时需要在较少损伤中枢神经系统的情况下，把细微的电极或导管，有目的的插入脑的某些深部结构，这种定向安置的技术为立体定位术(Stereotaxic technique of brain)。它是在脑内进行电刺激，记录细胞放电，进行微量注射及推挽灌流等项实验时必不可少的步骤.l某些颅外骨性标记与颅内结构具有相对固定的位置关系，

19、 因此可利用这些骨性标记并按大白鼠，兔脑图谱所提供的数据进行操作.根据鼠脑图谱(KNIG F.R. and KLIPPEL A.， 1963年)所定标准，取前囟点与人字缝尖(后囟)为连线，前囟高于后囟1mm为鼠脑标准头位，但不同的鼠脑图谱头位标准有所不同。 l 兔脑结构定位根据兔脑图谱(Sawyer， 1954)规定(图3-2-1-1)标准头位是前囟高于人字缝尖1.5mm，三个座标的定位依据是：以前囟中心及人字缝尖为标记点，在人字缝尖以上1.5mm的一点(假想点)与前囟中心连一线作为假想水平线，通过此线作一与定向器立框平行的平面即为标定水平面。 由此平面向下12mm的与其平行的平面即为水平座标

20、面(HO).HO平面向下为H-，向上为H+， 通过前囟中心与人字缝尖，并与水平座标平面垂直的平面即为矢状座标面(LPO)。 向左则标为L， 向右则标为R，通过前囟中心与水平及矢状座标面均垂直的平面即为冠状座标面(APO)，向前则为A，向后则为P.三个座标面均以mm记数，如A2R2H-1.5，P9L0.5H1等。神经通路示踪技术神经通路示踪技术l 而神经通路的追踪是研究中枢神经系统重要的手段之一。目前常用的研究方法主要有：利用神经元轴浆运输现象的追踪法，如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）、荧光染料（fluorscein）、放射性核素、葡萄聚糖（dextran

21、）追踪法、植物凝集素（lectin）及霍乱毒素（cholera toxin,CT）等等。利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法，包括传统的镀银法如Nauta法与目前常用的变性法与免疫组织化学方法或原位分子杂交技术结合，观察当切断束路(或神经)后起始神经元胞体内化学成分的变化利用某些荧光染料如羰花青（carbocyanine）荧光染料DiI、DiA、DiO、DiS在神经细胞质膜扩散的神经元质膜荧光追踪法Golgi法及活体内染料注射法l 常用的HRP追踪法、荧光素追踪法、放射性核素追踪法及Nauta镀银法 HRP追踪法追踪法 l HRP是从辣根中提取出

22、来的一组同工酶的混合物。Kristenson 等（1971）和LaVail等（1972）先后将HRP用于追踪神经纤维联系，创造了HRP追踪技术。HRP在注射部位被神经末梢或神经元胞体通过非特异性整体胞饮（bulk endocytosis）的方法摄入，逆向运至胞体或顺向运至末梢。HRP注射于周围神经感觉末梢部位逆向标记背根神经节细胞后，还可进一步沿背根神经节中枢突顺向标记其中枢终止部位，称跨节标记（transganglionic labeling）HRP和麦芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）共偶联后（WGAHRP）或与霍乱毒素结合后（CTHRP）可大大提高HRP作为追

23、踪剂的灵敏度HRP法的基本操作步骤是麻醉动物，HRP注射至中枢神经系统或周围器官、神经的一定部位，动物存活一定时间后灌注固定动物，取材制作冰冻切片，然后用过氧化氢及显色剂来显示HRP标记。l （一） HRP的配制l 中枢神经系内注射的HRP，一般用蒸馏水或生理盐水配成30%50%的溶液。微电泳时可用20%30%的HRP，也可用更低浓度的HRP，l （二） HRP的注射l 取实验动物麻醉后，将其固定于脑定位仪上，切开动物头部皮肤，暴露颅骨，选择适当的坐标，用开颅具在颅骨上开一小孔，将微玻管或微量注射器直接向脑内注射，HRP溶液用微量注射器注入。为了减少推进HRP溶液时液压对组织的损伤作用，注射速

24、度很慢。一般约为每10分钟0.1ul。用千分尺或电动自动推进器来推进。为了减少HRP沿针道扩散，在注射后应留针1530min再徐徐拔针，将动物皮肤缝合，存活。l （三）动物的存活l 注射追踪剂后经过多长时间处死动物，取决于被运送的速度、注射部位与标记部位间的距离、示踪物在标记部位逐渐堆积起来所需的时间以及示踪物在标记部位被分解的速度等因素。HRP被摄入的过程很快。在中枢神经系统内l5min后即可被摄入神经元中，经24后HRP已从细胞外间隙消失，全部进入细胞内(包括神经元、神经胶质、血管周细胞及血管内皮细胞等)。HRP可在轴突内被快速运送，通常认为顺向传递速度较快，每天可达300400nm，逆向

25、传递速度约为顺向速度的一半。HRP在标记部位有一个聚集的过程，同时HRP运至胞体后被送入溶酶体中水解。因此，需要在聚集及降解两个相反的过程中求一最佳标记效果时间，约为HRP开始到达标记部位后一天左右。 l （三）动物的固定l 动物存活一段时期后，再对动物进行麻醉，用灌注固定法对其进行固定。HRP对固定剂相当敏感，选择固定液是HRP示踪方法成功与否的一个关键。当初提出HRP方法时用10%甲醛作固定剂，常用1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的混合溶液。戊二醛1963年由Sabotini等介绍用于组织固定后被普遍认为是最好的固定剂之一，多用于保存电镜标本。它能较完好地固定组织的超微结构，虽对酶有一定程度

26、的破坏作用，但仍有相当程度的酶的活性得以保存下来。其主要缺点是穿透能力太小，如组织块稍大则其中央部分固定不好，故多在固定液中加入穿透力强的多聚甲醛及采用灌注加浸泡这两项措施来弥补之。l （四） 取材l 灌注后，立取出脑或脊髓，迅速投入上述固定液中后固定6h左右即可作振动切片。若行冰冻切片，将依次移入含10%、20%、30%蔗糖的0.01M磷酸缓冲液（pH7.27.4）中（4OC），直到组织完全下沉后，方可切片。l （五） 切片l 冰冻切片或振动切片，片厚2050m。切片收集于含5%蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液中，pH7.27.4。尽快作呈色反应，否则酶的活行随时间推移而减弱。l （六） 呈

27、色反应l 显示HRP的方法有多种。最初用二氨基联苯胺（3,3-diaminobenzidine,DAB）。以后在光学显微镜水平研究 上 ， 多 用 四 甲 基 联 苯 胺 ( 3 , 3 , 5 , 5 -tetramethylbenzidine,TMB),因其比DAB更为灵敏，可显示更多的顺行纤维，且无致癌作用。l DAB的氧化产物呈棕色颗粒，在暗视野下反射出金黄色光；TMB氧化产物呈深蓝色颗粒，在暗视野下呈橙色。DAB和TMB反应液的pH值要求不同，DAB要求pH6.0，而TMB则为pH3.3，TMB反应产物不如DAB的反应产物稳定，在pH7.0溶液中很快消失，但可用重金属盐（例如钴、镍、

28、钼、钨等）稳定之。l （六）结果观察l DAB反应物在神经元胞体内呈褐色圆粒，大小及分布较均匀，可扩展至树突近段内。除颗粒外，胞体内应无其他的棕色染色产物。如用Mesulam的联苯胺法或TMB法，HRP之反应颗粒呈蓝色，在明视野下清晰可辨。如果反应的颗粒很多，神经元的蓝色很浓时，用暗视野观察反而不清楚;但如颗粒较稀，还是暗视野更灵敏。有些标记神经元在明视野下仅勉强可辨或几乎不能分辨，但在暗视野下仍清晰可见。蓝色反应的颗粒在暗视野下呈橘黄色。l 荧光素追踪法荧光素追踪法l 荧光染料追踪法主要用作逆行追踪。有的染料也可被用于顺行追踪，但标记较弱。荧光染料的种类很多，按荧光染料的标记部位可将它们分为两类，一类主要标记细胞核，如核黄(nuclear yellow)和diamidino yellow，另一类主要标记细胞浆，如固蓝(fast blue)和荧光金(fluoro-gold)，多数荧光染料属后者