实验六-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定ppt课件

1、酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定 蔗糖酶活性及比活性测定原理蔗糖酶活性及比活性测定原理+蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖酶的酶活单位：在40水浴反响10min，测定吸光值A540，添加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位U。 蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的纯度越高。试剂试剂一一 蔗糖酶的粗提及活性测定蔗糖酶的粗提及活性测定 1 1冰冻无水乙醇：冰冻无水乙醇：1 1瓶瓶/ /班班 2 20.01 mol/L pH6.0 PBS buffer0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer，2000ml 2000ml

2、 全班共用全班共用 3 30.01mol/L0.01mol/L蔗糖蔗糖, , 用用0.01 mol/L pH6.0 0.01 mol/L pH6.0 PBS bufferPBS buffer配制，配制，200ml 200ml 大组共用大组共用 4 42 mol/L NaOH2 mol/L NaOH， 1000ml 1000ml 全班共全班共用用 5 53,5-3,5-二硝基水扬酸二硝基水扬酸(DNS)(DNS)试剂：可配试剂：可配300ml 300ml 全班共用全班共用19.219.2克酒石酸钾钠溶于克酒石酸钾钠溶于50ml50ml水中电炉加热溶水中电炉加热溶解，不用沸腾，把解，不用沸腾，把.

3、0.63.0.63克克3,5-3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)(DNS)和和26.2ml2 mol/L NaOH 26.2ml2 mol/L NaOH 加到酒石酸钾钠的加到酒石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到热溶液中，电炉加热溶解，冷却到50-6050-60，再，再加加0.50.5克苯酚和克苯酚和0.50.5克亚硫酸钠搅拌使溶解冷克亚硫酸钠搅拌使溶解冷却后加水定容至却后加水定容至100ml100ml，过滤，贮于棕色瓶中。，过滤，贮于棕色瓶中。实验方法实验方法一粗提取酵母蔗糖酶一粗提取酵母蔗糖酶 1 量取量取5g的面包酵母，分几次研磨参的面包酵母，分几次研磨参与少量石英砂至粉状，

4、再参与与少量石英砂至粉状，再参与10-12ml的的0.01mol/LPBSpH 6.0，搅拌混合。置于小，搅拌混合。置于小烧杯中。烧杯中。 2 置于置于20冰箱中，反复冻融冰箱中，反复冻融1-2次。次。二热提取酵母蔗糖酶二热提取酵母蔗糖酶 3 3 解冻，然后置于离心管中，离心，转速解冻，然后置于离心管中，离心，转速11000r/min11000r/min离心离心10min10min，离心后取上清液，按下表，离心后取上清液，按下表2 2、3 3方法分别测蔗糖酶方法分别测蔗糖酶A A的活性及蛋白含量蛋白含量的活性及蛋白含量蛋白含量略。略。 4 4 将上述上清液置于将上述上清液置于4545的恒温水浴

5、锅中，的恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌用玻璃棒缓慢搅拌30min30min，然后置于冰浴中迅速冷却，然后置于冰浴中迅速冷却5min5min。然后装入离心管中，离心，转速。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min11000r/min条条件下离心件下离心10min10min，离心后取上清液，按下表，离心后取上清液，按下表2 2、3 3方法方法分别测蔗糖酶分别测蔗糖酶B B的活性及蛋白含量。的活性及蛋白含量。三乙醇提取酵母蔗糖酶三乙醇提取酵母蔗糖酶 1 1取上述第取上述第4 4步中的上清液步中的上清液10ml10ml，缓慢，缓慢参与参与10ml10ml的冰冻的无水乙醇乙醇的终浓度为的冰冻的无

6、水乙醇乙醇的终浓度为5050，并悄然的搅拌，并悄然的搅拌5min5min，此过程在冰浴中，此过程在冰浴中进展。然后装入离心管中，转速进展。然后装入离心管中，转速3000r/min3000r/min条条件下离心件下离心5min5min，离心后弃上清液，离心管倒置，离心后弃上清液，离心管倒置于滤纸上，尽能够去除乙醇残液。留沉淀。于滤纸上，尽能够去除乙醇残液。留沉淀。 2 2将沉淀用将沉淀用15ml15ml的的0.01mol/L0.01mol/L的的PBSPBSpH6.0pH6.0搅拌溶解搅拌溶解30min30min，溶液为浑浊液，再，溶液为浑浊液，再离心，转速离心，转速10000r/min1000

7、0r/min条件下离心条件下离心10min10min，离，离心后取上清液，按下表心后取上清液，按下表2 2、3 3方法分别测蔗糖酶方法分别测蔗糖酶C C的活性及蛋白含量。的活性及蛋白含量。表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定 试剂对照管粗提A1粗提A2热提B1热提B2醇提C1醇提C20.1mol/L蔗糖（ml）0.20.20.20.2 0.20.20.22 mol/L NaOH（ml）0.100000040恒温水浴准确保温10min各组酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.01 mol/L pH6.0 PBS（ml）0.140恒温水浴中准确反应10min2 mol/L NaOH（ml）0.10.10.10.10.10.1DNS（ml）0.50.50.50.50.50.50.5100沸水浴准确加热5min，立即冷却蒸馏水（ml）5555555摇匀，以对照管作空白A5400酶活（U）0酶比活力（U/mg ）0酶比活力平均值（U/mg ）0留意：留意：对看管的颜色不能太深，假设太深，需求重新对看管的颜色不能太深，假设太深，需求重新配