细胞培养1培养基制备26相差显微镜PPT学习教案

1、会计学1细胞培养（细胞培养（cell culture)cell culture) 是指用机械或化学的方法将是指用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培组织分散成单个细胞而进行的培养。养。 组织培养（组织培养（tissue culture)tissue culture) 是指把活体的组织取出分成小是指把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。其特点是：组织不失散，细培养。其特点是：组织不失散，细胞保持原有的组织关系。胞保持原有的组织关系。器官培养（器官培养（organ culture

2、organ culture） 是将活体中器官或器官一部分是将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的保持器官原有的结构和功能特征的培养。其特点是：培养的器官在合培养。其特点是：培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数适的条件下能生长和分化，存活数周或周或1年。年。第1页/共40页第2页/共40页细胞群体。细胞群体。第3页/共40页生物安全柜超净工作台第4页/共40页漳州校区细胞实验课使用的细胞培养间.第5页/共40页水浴锅高压灭菌锅第6页/共40页培养瓶培养皿培养板第7页/共40页CO2 培养箱第8页/共40页倒置显微

3、镜普通显微镜第9页/共40页l 培养基培养基血清 胰酶双抗(Penicillin-Streptomycin) 第10页/共40页常见的商品化细胞培养基有:DMEM、MEM、PRMI-1640、 M199、Hams/F12等第11页/共40页第12页/共40页第13页/共40页第14页/共40页第15页/共40页第16页/共40页第17页/共40页温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响第18页/共40页第19页/共40页第20页/共40页第21页/共40页培养细胞的污染培养细胞的污染Amphotericin B（两性霉素） pen/strep （双抗）第22页/共40页培养细胞的污染培养细胞的

4、污染PlasmocinAmphotericin B（两性霉素） 第23页/共40页实验七、细胞培养基配制与过滤除菌实验目的：熟练掌握培养基(DMEM)的配制及过滤除菌的方法实验原理：组织培养使用的培养基其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。L谷氨酰胺在细胞培养时是必须的，脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在高压灭菌后被大幅降解而产生大量毒性氨,对细胞有毒性。因而含有L谷氨酰胺的培养基不能用高压灭菌的方式除菌。一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH 的缓冲系统，由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很

5、不稳定，因而含有NaCO3的培养基也不能用高压灭菌的方式除菌。市售培养基可分为两种：一是可进行高压灭菌的培养基，这类培养基不含L谷氨酰胺和NaCO3，须灭菌后再添加L谷氨酰胺和NaCO3。另一种是含有L谷氨酰胺，配制的同时在添加NaCO3，这类培养基不能用高压灭菌德的方式除菌，只能采用过虑除菌的方式。第24页/共40页第25页/共40页DMEM培养基的配制 1 称量一定量的DMEM干粉，倒入1000ml烧杯中，加入950ml 去离子水，用磁力搅拌至充分溶解，然后加入适量NaHCO3，溶解后先加入10ml 双抗（100unit青霉素,100ug/ml链霉素，最后加 水1000ml，分装到4个25

6、0ml烧杯中。 第26页/共40页第27页/共40页2.超净工作台预先紫外照射至少20min,关掉紫外灯，通风2-3min,戴上乳胶手套，喷酒精消毒。第28页/共40页用酒精喷软纸将超净工作台平台及工具擦拭干净。第29页/共40页3. 将上面分装的250ml烧杯放入超净工作台，在超净工作台中用镊子取出过0.22m过滤 器，放在 250ml蓝盖瓶瓶口。取20ml一次性注射器吸取一定量的 培养基，通过0.22m过滤器注入250ml蓝盖瓶中。过滤全部结束后，将蓝盖瓶盖紧。贴上标签。4冰箱保存。第30页/共40页取20ml一次性注射器吸取一定量的 培养基，通过0.22m过滤器注入250ml蓝盖瓶中。过

7、滤全部结束后，将蓝盖瓶盖紧。贴上标签。4冰箱保存。第31页/共40页4.标签标记方法：DMEM 31110316 xxxxx星期二实验组第一排作业：配制细胞培养基时为什么要添加NaHCO3?第32页/共40页一一. . 实验目的实验目的 1.1.了解相差显微镜的基本原理和结构特点。了解相差显微镜的基本原理和结构特点。 2. 比较活细胞与固定后细胞的形态差异。比较活细胞与固定后细胞的形态差异。实验八实验八 活细胞观察及相差显微镜的使用活细胞观察及相差显微镜的使用l 人的眼睛只在光的波长人的眼睛只在光的波长(颜色颜色)和振幅和振幅(亮度亮度)变化时才能观察到被检的物体，而变化时才能观察到被检的物体

8、，而活细胞或末经染色标本多为无色透明，活细胞或末经染色标本多为无色透明，当光波被通过时，其波长和振幅并没发当光波被通过时，其波长和振幅并没发生什么变化，所以无法辨认。为了观察生什么变化，所以无法辨认。为了观察活细胞的显微结构，就需要使用相差显活细胞的显微结构，就需要使用相差显微镜。微镜。l相差显微镜是一种将光线通过透明标相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。转化为光强差的特种显微镜。第33页/共40页二二. 实验原理实验原理 细胞各部分的折射率和厚度的不同细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，

9、直射光和衍，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置微镜能通过其特殊装置-环状光阑和环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，现出明显的明暗差

10、异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。结构。 第34页/共40页第35页/共40页第36页/共40页三、实验程序三、实验程序 (一一)相差显微镜的使用相差显微镜的使用 1. 相差显微镜的装置相差显微镜的装置 取下普通显微镜的聚光器，换上带有环状光相的转盘聚光器，并将标取下普通显微镜的聚光器，换上带有环状光相的转盘聚光器，并将标示孔指示孔指0(即明视野即明视野);取下普通物镜，装上相差物镜。取下普通物镜，装上相差物镜。 2

11、. 调焦和调光调焦和调光 用普通低倍物镜在明视野中观察，当发现目标后，把观察的目的物移用普通低倍物镜在明视野中观察，当发现目标后，把观察的目的物移到视野的中央。观察透明物体时要缩小光栏，当用相差物镜在明视野对好到视野的中央。观察透明物体时要缩小光栏，当用相差物镜在明视野对好焦点后，换上相应的相差物镜，例如焦点后，换上相应的相差物镜，例如20X,40 x相差物镜分别用相差物镜分别用ph1、ph2标标示孔的光栏，并充分开大孔径光栏。示孔的光栏，并充分开大孔径光栏。 第37页/共40页3. 中心调节（合轴调节）中心调节（合轴调节） 拨出目镜，插入中心望远镜，用左手固定其外筒，一边眼看望远镜，一边用右

12、手转动望远镜内筒使其升降，对准焦点后就能看到环状光栏的亮环和相板的黑环。此时可将望远镜固定，微微转动聚光器两侧的调节钮，使两者完全重合。如果亮环和黑环大小一不致，可升降聚光器便之一致，如果升降聚光器仍不能矫正亮环和黑环一致的话，那就是载、盖玻片过厚的缘故。换用不同物镜要同时更换相对应的环状光栏，并重新合轴拨出目镜，插入中心望远镜，用左手固定其外筒，一边眼看望远镜，一边用右手转动望远镜内筒使其升降，对准焦点后就能看到环状光栏的亮环和相板的黑环。此时可将望远镜固定，微微转动聚光器两侧的调节钮，使两者完全重合。如果亮环和黑环大小一不致，可升降聚光器便之一致，如果升降聚光器仍不能矫正亮环和黑环一致的话

13、，那就是载、盖玻片过厚的缘故。换用不同物镜要同时更换相对应的环状光栏，并重新合轴。第38页/共40页 (二二)动物活细胞的相差显微镜观察动物活细胞的相差显微镜观察 观察蛙肝细胞装片观察蛙肝细胞装片 1.用镊子和解剖针，把蛙的肝组织小块放在载玻片上，滴上生用镊子和解剖针，把蛙的肝组织小块放在载玻片上，滴上生理盐水，分离出游离肝细胞。在相差显微镜下，可见折射率较高理盐水，分离出游离肝细胞。在相差显微镜下，可见折射率较高的大的球形细胞核，内含折射率更高的小颗粒的大的球形细胞核，内含折射率更高的小颗粒 核仁。在细胞核核仁。在细胞核周围还可见到许多暗白的小颗粒即为线粒体。细胞质中还有许多周围还可见到许多暗白的小颗粒即为线粒体。细胞质中还有许多大小不等明亮的细胞质颗粒。大小不等明亮的细胞质颗粒。 2.取一小块肝组织，放入取一小块肝组织，放入1.5ml离心管中，离心管中，生理盐水洗生理盐水洗1次，去次，去除上清液，用眼科剪剪碎肝组织至糊状除上清液，用眼科剪剪碎肝组织至糊状，生理盐水洗生理盐水洗1遍，遍， 3000rpm离心离心2min去上清，去上清，加入加入500微升胰蛋白微升胰蛋白酶，酶，37温育温育10-20min10-20min，其间用，其间用1ml1ml枪头吹打枪头吹打2-32-3次。次。 3.3.加入加入500500微升生理盐水后微升生理盐水