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文档简介
1、会计学1一、光学显微镜技术(一)普通光学显微镜1.结构: 照明系统 :光源和聚光器 光学放大系统 :物镜和目镜 机械装置 :用于固定材料和观察方便 第1页/共90页双筒显微镜第2页/共90页单筒显微镜第3页/共90页2.原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。第4页/共90页3.几个概念: 放大(率)倍数:显微镜最后形成的物体放大像与被检物体的大小比例, 即像高比物高。分辨力(resolving power):指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力。数值孔径(镜口率)(Numeric Aperture) : NA=sin(/2)第5页/共90页。第6页/共90
2、页第7页/共90页第8页/共90页(二)相差显微镜(phase-contrast microscope,PCM) 由PZernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别。P31在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: 1.环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的
3、相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4 第9页/共90页环状光阑环状光阑装在聚光镜的下方,而与聚光镜组合为一体装在聚光镜的下方,而与聚光镜组合为一体相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内,外面标有相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内,外面标有10X、20X、40 X、100X等字样,与相对应倍数的物镜配合使用。等字样,与相对应倍数的物镜配合使用。第10页/共90页原理图:第11页/共90页第12页/共90页当两束光通过光学系统时会发生相互干涉,如果相位相同,干涉的结果是亮度增强,反之,就会相互抵消变暗,这就是光波的干涉现象。 微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源,光线经
4、棱镜折射后分成两束,在不同时间经过样品的相邻部位,然后经过另一棱镜将这两束光汇合,从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别,增加了样品反差,造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕。 微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器,如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。第13页/共90页(三) 荧光显微镜 技术 (Fluorescence microscope) 1.荧光显微镜的特点: 光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜 第14页/共90页照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上 有两个特殊的滤光片,激发光滤片用以滤除可见光,目镜和物镜之间的阻断滤片用
5、于滤除紫外线,用以保护人目第15页/共90页荧光显微镜照片(微管呈绿色、DNA蓝色) 荧光标记:同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记第16页/共90页(四)、激光扫描共焦显微境 第17页/共90页激光共聚焦扫描显微镜光路图第18页/共90页第19页/共90页激光扫描共焦显微镜的特点:v用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像 ,能显示细胞样品的立体结构v分辨率大约是普通光学显微镜的3倍 v用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像v扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点 第20页/共90页LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管 第21
6、页/共90页(五)暗视野显微镜光路图聚光镜中央有挡光片,视野背景是黑的,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,物体边缘是亮的。可观察 4200nm的微粒子,分辨率比普通显微镜高50倍。第22页/共90页(六)倒置显微镜第23页/共90页第24页/共90页二、电子显微镜技术(electron microscope )(一)、透射电子显微镜 (transmission electron microscope,TEM) 1932年Ruska发明第25页/共90页原理:(电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样 )v 用电子束作光源,用电磁场作透镜 ,电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比,也就是
7、说电压越高波长越短.v分辨率0.2nm,放大倍数为数百万倍.v用于观察超微结构(ultrastructure),及小于0.2 m ,光镜下无法看清的结构.第26页/共90页光镜与电子显微镜光镜与电子显微镜(透射电镜透射电镜)的结构的结构第27页/共90页3.制样技术:1)超薄切片技术 :步骤:P36电子束穿透力很弱, 超薄切片厚度仅50nm左右,用超薄切片机(ultramicrotome)制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品,丙酮逐级脱水,环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式切片,重金属(铀、铅)盐染色。第28页/共90页莱卡超薄切片机第29页/共90页内质网透射电镜图第30页/共90页Nega
8、tive Stained Archaebacteria 第31页/共90页3)冰冻蚀刻 (freeze-etching ):v 标本置于-100度的干冰或-196度的液氮中,进行快速冰冻。v用冷刀骤然将标本断开 v升温,冰在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构-蚀刻 v向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角喷涂一层碳,加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂的膜剥下来,此膜即为复膜(replica)。复膜显示出了标本蚀刻面的形态,在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 第32页/共90页冰冻断裂与冰冻蚀刻技术第33页/共90页(二)、扫描电子显微镜(scanning
9、 electron microscope,SEM) 20世纪60年代问世,用来观察标本的表面结构. 第34页/共90页用一束极细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子的多少与电子束入射角有关,也就是说与样品的表面结构有关,次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。第35页/共90页第36页/共90页(三)、扫描隧道显微镜 (sca
10、nning tunneling microscope,STM) v 由Binnig等1981年发明 ,是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器. 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时,此处电子云重叠,外加一电压(2mV2V),针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出,形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系,当探针沿物质表面按给定高度扫描时,因样品表面原子凹凸不平,使探针与物质表面间的距离不断发生改变,从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。第37页/共90页v利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子,如D
11、NA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵,和某些生物结构,如生物膜、细胞壁等的原子排列。v分辨率很高,横向为0.10.2nm,纵向可达0.001nm v优点是三态(固态、液态和气态)物质均可进行观察,而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 第38页/共90页 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、离心技术(一 ) 、细胞破碎:(二)、差速离心(differential centrifugation)v在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。 v差速离心只用于分离大小悬殊的细胞,更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离 第39页/共90页速度逐
12、渐提高,样品按大小先后沉淀 第40页/共90页(三)、密度梯度离心(density gradient centrifugation): 1、速度沉降(velocity sedimentation):v用途:用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 v特点:介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度 v原理:介质密度梯度十分平缓,生物颗粒(细胞或细器)按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离 第41页/共90页2、等密度沉降 (isopycnic sedimentation): v用途:用于分离密度不等的颗粒 v特点: 介质密度较高,陡度大,介质的最高密度应大于被分离组分的最大
13、密度;所需要的力场通常比速率沉降法大10100倍,故往往需要高速或超速离心 v原理: 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力或足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离 第42页/共90页第43页/共90页第44页/共90页vPAS反应反应: 显示多糖的存在显示多糖的存在 利用希夫利用希夫(Schiff)试剂试剂 糖原由D-葡萄糖的分支或直链组成,过碘酸是一种强氧化剂,能将葡萄糖中乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成二个游离醛基(CHO),游离醛基与Schiff s试剂反应生成紫红色产物,颜色深浅与多糖含量成正比。第45页/共9
14、0页第46页/共90页第47页/共90页氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒。第48页/共90页第49页/共90页第50页/共90页第51页/共90页五、定量细胞化学分析技术(一)、流式细胞仪v
15、流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术 v原理:包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴,形成包含单个细胞的液滴,在激光束的照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检测,转换为电信号,送入计算机处理,输出统计结果,并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群,分离纯度可达99% v包被细胞的液流称为鞘液,所用仪器称为流式细胞计(flow cytometer) 第52页/共90页第53页/共90页第54页/共90页第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程一、细胞培养细胞培养(cell culture):选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。第55页/共90页人的(一)
16、动物细胞培养细胞培养 1.原代细胞 :2.传代细胞:3.细胞贴壁:4.接触抑制:第56页/共90页5.细胞系(cell line):原代细胞度过传代危机又能进行传代的细胞。 有限细胞系、永生细胞系。实验室常见的细胞系第57页/共90页第58页/共90页第59页/共90页植物组织培养 第60页/共90页植物原生质体培养 第61页/共90页泡运输,细胞周期调控、核膜及染色质的组装、核质运输机制等。第62页/共90页:第63页/共90页细胞融合 第64页/共90页第65页/共90页培养上清中培养上清中X X抗体的检测抗体的检测克隆化培养克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X
17、 X抗体的检测抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养规模化培养获得大量单克隆抗获得大量单克隆抗体体动物免疫动物免疫 分泌分泌X X抗体抗体B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞X X抗原抗原淋巴细胞淋巴细胞瘤的突变株瘤的突变株培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌X X抗体抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来第66页/共90页终末分化细胞终末分化细胞B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性:淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性:杂交瘤技术与单克隆抗体杂交瘤技术与单克隆抗体第67页/共90页骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (myeloma cells):恶性增殖的转化细胞,只要营养条恶性增殖的转化细胞,只要营养条件适合可永远分裂和存活件适合可永远分裂和存活长命细胞长命细胞。经筛选与驯化,现已建立多种骨髓经筛选与驯化,现已建立多种骨髓瘤细胞株瘤细胞株没有抗体分泌物。没有抗体分泌物。第68页/共90页2. 细胞融合技术:细胞融合技术:第69页/共90页第70页/共90页H, 次黄嘌呤次黄嘌呤; A, 氨基喋呤氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶胸腺嘧啶HAT培养基筛选第71页/共9
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