病毒学 病毒的侵染与复制PPT学习教案

1、会计学1病毒学病毒学 病毒的侵染与复制病毒的侵染与复制第1页/共102页第2页/共102页第3页/共102页 二、噬菌体二、噬菌体(phage)(phage)的繁殖的繁殖噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：根据噬菌体与宿主的关系：烈性噬菌体烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体的噬菌体. .温和噬菌体（

2、或溶源性噬菌体）：温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核将其核酸整合（附着）到宿主的核DNADNA上，并且可以随宿上，并且可以随宿主主DNADNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。主细胞裂解的噬菌体。第4页/共102页烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：吸附、侵入、复制、装配和释放吸附、侵入、复制、装配和释放。1 1、烈性噬菌体的繁殖、烈性噬菌体的繁殖第5页/共102页吸附：吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异性吸噬菌体和宿主细胞

3、上的特异性吸附部位进行特异性结合，噬菌体以尾丝牢附部位进行特异性结合，噬菌体以尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突固吸附在受体上后，靠刺突“钉钉”在细胞在细胞表面上。表面上。侵入：侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌体尾核酸注入细胞的过程。噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外。复制复制 ：包括核酸的复制和蛋白质合成。包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主细胞的

4、合成系统，然后以噬菌体核酸中的细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。第6页/共102页装配：装配：主要步骤有：主要步骤有：DNADNA分子的缩合分子的缩合通过衣壳包裹通过衣壳包裹DNADNA而形成头部而形成头部尾丝及尾部尾丝及尾部的其它部件独立装配完成的其它部件独立装配完成头部与尾部相结合头部与尾部相结合最后装上尾最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。第7页/共102页释放：释放：方式：方式：裂解：包括裂解：包括T4T4噬菌体在内的大多噬菌体在内的大

5、多数噬菌体以裂解细胞的方式释放。数噬菌体以裂解细胞的方式释放。分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。（丝状噬菌体）不裂解。（丝状噬菌体）通常情况下，一个噬菌体通过上述通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成五个过程能合成100300100300个噬菌个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长，式也称为一步生长，第8页/共102页第9页/共102页第10页/共102页（2 2）实验过程）实验过程: :敏感菌敏感菌10ml Phage 1ml 混匀，混匀，5min,使之吸附使之吸附 离心或用抗离心或用抗phage血清处理血清处理

6、, 去除过量去除过量phage 高倍稀释高倍稀释,吸附吸附phage的菌悬液的菌悬液(避免多次吸附避免多次吸附) 37培养培养,定时取样定时取样 第11页/共102页噬菌斑噬菌斑: :概念：概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上, ,可以用肉可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。( (每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。) ) 应用应用: : 噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬

7、菌体和进行噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。噬菌体的计数。噬菌斑噬菌斑第12页/共102页第13页/共102页 取样人为裂解处理（每取样人为裂解处理（每5min） 样品中加入氯仿裂解细胞样品中加入氯仿裂解细胞 24-48h 裂解液加入敏感菌液中裂解液加入敏感菌液中 适当稀释混合液适当稀释混合液 计数噬菌斑计数噬菌斑第14页/共102页第15页/共102页 以培养时间为横以培养时间为横坐标坐标,以噬菌斑数以噬菌斑数为纵坐标为纵坐标,绘制成绘制成的曲线为一步生的曲线为一步生长曲线。长曲线。 可分以下阶段：可分以下阶段： 潜伏期潜伏期(latent phase) 裂解期裂解期(b

8、urst phase) 稳定期稳定期(plateau phase) 第16页/共102页11001010203040Eclipse phaseLatent phaseRise phasePlateau phase一步生长曲线Time(min)Plaque numberFig. One-step growth curve of T2One-step growth curveGrowth curve in host bacteria第17页/共102页潜伏期：潜伏期：从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体之前的这段时期。曲线平行于横轴，噬菌体数无变化之前的

9、这段时期。曲线平行于横轴，噬菌体数无变化。样品中无游离的噬菌体。样品中无游离的噬菌体。( (潜伏期前的噬菌斑数是潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数噬菌体数, ,也就是感染噬菌体的细菌数也就是感染噬菌体的细菌数).). 病毒在感染细胞内消失到细胞内重新出现新的感染病病毒在感染细胞内消失到细胞内重新出现新的感染病毒的时期为毒的时期为隐蔽期隐蔽期(eclipse period)(eclipse period)。 裂解期：裂解期：曲线直线上升，子代噬菌体不断释放到培养基曲线直线上升，子代噬菌体不断释放到培养基中中, ,直到达到一个极限。直到达到一个极限。稳定期稳定期: :感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，

10、噬菌斑感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。数稳定，一次感染结束。第18页/共102页裂解量裂解量: :每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。 稳定期噬菌斑数稳定期噬菌斑数 裂解量裂解量 = = 潜伏期噬菌斑数潜伏期噬菌斑数 不同的噬菌体或同不同的噬菌体或同种噬菌体感染敏感菌后所释放种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同，与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及的噬菌体数不同，与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及环境因数有关。环境因数有关。 T4 T4约为约为100100，X174X174约为约为10001000，f2f2高达高达100

11、0010000、T2T2仅为仅为200200。 第19页/共102页后来后来MOI被普遍用于病毒感染细胞被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。胞数量的比值。第20页/共102页 3 3、温和噬菌体与溶源性细、温和噬菌体与溶源性细菌菌温和噬菌体温和噬菌体( (temperature phage) )：噬菌体感染噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNADNA上，并且可以随宿主上，并且可以随宿主DNADNA的复制而进行同步复制的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌，在一

12、般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。体。原噬菌体（或前噬菌体原噬菌体（或前噬菌体,prophage,prophage）：）： 即整合即整合在宿主核在宿主核DNADNA上的噬菌体的核酸。上的噬菌体的核酸。 溶原性细菌溶原性细菌( (lysogenic bacteria) )：指在核染色体指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。殖，而不被裂解。 第21页/共102页溶原性细菌的特点：溶原性细菌的特点：可稳定遗传：可稳定遗传：子代细菌都含有子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。原噬菌体，均具有溶原性。可自发裂解：可自发裂解：温和噬

13、菌体的核酸也可从宿主温和噬菌体的核酸也可从宿主DNADNA上脱落下来，恢复上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率1010-2-21010-5 -5 。可诱导裂解：可诱导裂解：用化学、物理方法诱导用化学、物理方法诱导具有具有“免疫性免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。性。可复愈：可复愈：自然遗失前噬菌体，但不发生自发裂解和诱导裂解自然遗

14、失前噬菌体，但不发生自发裂解和诱导裂解 溶源转变：溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。些新的生理特征。第22页/共102页物中生长物中生长第23页/共102页第24页/共102页和方便。和方便。四、植物病毒四、植物病毒植物原生质体培养系统植物原生质体培养系统第25页/共102页第26页/共102页第27页/共102页第28页/共102页脱离细胞。脱离细胞。第29页/共102页第30页/共102页第31页/共102页第32页/共102页第33页/共102页第34页/共102页第35页/共102页第36页/共102页

15、第37页/共102页肠孤病毒、乳多空病毒。（有囊膜肠孤病毒、乳多空病毒。（有囊膜及无囊膜病毒）及无囊膜病毒）第38页/共102页第39页/共102页第40页/共102页第41页/共102页第42页/共102页第43页/共102页在核酸复制开始或复制后进行在核酸复制开始或复制后进行的转录称为晚期转录，晚期蛋白主的转录称为晚期转录，晚期蛋白主要是病毒的结构蛋白。要是病毒的结构蛋白。第44页/共102页第45页/共102页 半保留复制半保留复制第46页/共102页第47页/共102页 全保留复制全保留复制第48页/共102页 后来，学术界将嗜肝后来，学术界将嗜肝DNA病毒科和花椰菜花叶病毒科另列一组

16、，这类病毒的病毒科和花椰菜花叶病毒科另列一组，这类病毒的dsDNA复制必须经过逆转录产生复制必须经过逆转录产生DNA(前基因组前基因组)第49页/共102页第50页/共102页 痘病毒、虹彩病毒、疱疹病毒、腺病毒：痘病毒、虹彩病毒、疱疹病毒、腺病毒： mRNA 蛋白质蛋白质 dsDNA 病毒组装病毒组装 dsDNA第51页/共102页病毒病毒（）DNA病毒病毒（）DNA子代病毒子代病毒即早蛋白即早蛋白早期蛋白早期蛋白晚期蛋白晚期蛋白 mRNA mRNA mRNA类类第52页/共102页细小病毒、圆环病毒：细小病毒、圆环病毒： mRNA 蛋白质蛋白质ssDNA dsDNA 病毒组装病毒组装 ss

17、DNA第53页/共102页病毒病毒（+ +）DNA子代子代（+ +）DNA细胞蛋白细胞蛋白病毒蛋白病毒蛋白子代病毒子代病毒 mRNA（）DNA类类第54页/共102页呼肠孤病毒、双呼肠孤病毒、双RNA病毒：病毒： mRNA 蛋白质蛋白质 dsRNA 病毒组装病毒组装 dsRNA第55页/共102页病毒病毒（）RNA子代子代（）RNA病毒病毒蛋白蛋白部分装配部分装配子代病毒子代病毒 mRNA病毒酶病毒酶类类第56页/共102页微小微小RNA病毒、杯状病毒、披盖病毒、黄病毒、冠状病病毒、杯状病毒、披盖病毒、黄病毒、冠状病毒、动脉炎病毒：毒、动脉炎病毒： 蛋白质蛋白质 （裂解）（裂解）+ssRNA

18、+ssRNA 病毒组装病毒组装 -ssRNA dsRNA第57页/共102页病毒病毒（+ +）ssRNA子代子代（+ +）ssssRNA多聚蛋白多聚蛋白蛋白加工蛋白加工子代病毒子代病毒dsRNA结构蛋白结构蛋白非结构蛋白非结构蛋白类类第58页/共102页DNA转录转录多顺反子多顺反子mRNA启动子启动子基因基因1基因基因2基因基因3DNA转录转录启动子启动子基因基因单顺反子单顺反子mRNA第59页/共102页第60页/共102页病毒病毒（+ +）ssRNA子代子代（+ +）ssRNA非结构蛋白非结构蛋白mRNA子代病毒子代病毒结构蛋白结构蛋白类类全长全长（- -）ssRNA第61页/共102页

19、正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒、丝状病毒等：正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒、丝状病毒等： 蛋白质蛋白质-ssRNA +ssRNA 病毒组装病毒组装 -ssRNA第62页/共102页分段的基因组（正黏病毒科），复制在细胞核发生，复制分段的基因组（正黏病毒科），复制在细胞核发生，复制的第一步是，病毒粒子的的第一步是，病毒粒子的RNA依赖的依赖的RNA聚合酶转录产生单聚合酶转录产生单顺反子顺反子mRNAs，该，该mRNA也作为模板启动基因组复制；也作为模板启动基因组复制；病毒病毒（- -）ssRNA子代子代（- -）ssRNA病毒蛋白病毒蛋白子代病毒子代病毒mRNA类类病毒酶病毒酶第63页/共102页病

20、毒病毒（- -）ssRNA子代子代（- -）ssRNA病毒蛋白病毒蛋白子代病毒子代病毒（+）ssRNA类类病毒酶病毒酶mRNA第64页/共102页反转录病毒：反转录病毒： mRNA 蛋白质蛋白质+ssRNA dsDNA 整合到宿主整合到宿主 病毒组装病毒组装 细胞基因组细胞基因组 +ssRNA 第65页/共102页病毒病毒2（+ +）ssRNA前病毒前病毒 dsDNA子代病毒子代病毒（+）ssRNA（- -）ssDNA类类病毒反转录酶病毒反转录酶mRNA病毒蛋白病毒蛋白第66页/共102页嗜肝病毒：嗜肝病毒：ss/dsDNA mRNA 蛋白质蛋白质 病毒组装病毒组装 dsDNA ss/dsDN

21、A第67页/共102页病毒开环病毒开环 dsDNA超螺旋超螺旋 dsDNA子代病毒子代病毒（- -）ssDNA（+ +）ssRNA类类反转录反转录病毒蛋白病毒蛋白dsDNA第68页/共102页期蛋白，即非病毒结构成分不组装期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。入病毒，残留在感染细胞中。第69页/共102页前体蛋白进行加工，稳定装配步骤。前体蛋白进行加工，稳定装配步骤。第70页/共102页制周期。一个感染细胞一般释放的制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为病毒数约为100-1000100-1000。第71页/共102页第72页/共102页第73页/共102页第74页/共102

22、页第75页/共102页第76页/共102页之中。之中。第77页/共102页第78页/共102页有感染性的病毒颗粒。有感染性的病毒颗粒。第79页/共102页第80页/共102页第81页/共102页第82页/共102页第83页/共102页美国加州大学旧金山分校神经科主任美国加州大学旧金山分校神经科主任Prusiner于于80年代初首次发现，并因此获年代初首次发现，并因此获1997年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖第84页/共102页 使普通使普通DNA及及RNA病毒失去感染性的紫外光剂量不能使病毒失去感染性的紫外光剂量不能使脑组织匀浆中的朊病毒蛋白失去感染性。脑组织匀浆中的朊病毒蛋白失去

23、感染性。 蛋白提取物经蛋白提取物经DNA酶及酶及RNA酶作用后仍具有较强的感染酶作用后仍具有较强的感染性。性。 经蛋白酶、蛋白变性剂处理后，蛋白提取物失去感染性经蛋白酶、蛋白变性剂处理后，蛋白提取物失去感染性。 福尔马林溶液不能完全消除朊病毒的感染性。福尔马林溶液不能完全消除朊病毒的感染性。蛋白质致病假说的依据蛋白质致病假说的依据第85页/共102页PrPsc与与PrPc的基本特征比较的基本特征比较1. 朊病毒是一种蛋白酶抗性蛋白（朊病毒是一种蛋白酶抗性蛋白（proteinase resistant protein, PrP）。）。 表达组织：中枢神经系统、淋巴系统。表达组织：中枢神经系统、淋

24、巴系统。 存在位置：细胞膜。存在位置：细胞膜。 无核酸结构，可抵抗非变性去污剂、核酸无核酸结构，可抵抗非变性去污剂、核酸酶的作用。因其分子量为酶的作用。因其分子量为2730kD，称为，称为PrP2730。第86页/共102页PrPsc。第87页/共102页耐受蛋白酶的消化和常规消毒作用，只有强碱耐受蛋白酶的消化和常规消毒作用，只有强碱(10N NaOH )， 高压消毒高压消毒(136，2小时小时)才能灭活；才能灭活；2. 不含核酸，用常规不含核酸，用常规PCR无法检测；无法检测；3. 超长的潜伏期（平均超长的潜伏期（平均20年），发病前无法检测和诊断；年），发病前无法检测和诊断；4. 变异和跨

25、种族感染，具有大量的潜在感染来源，主要为牛、变异和跨种族感染，具有大量的潜在感染来源，主要为牛、 羊等反刍动物，传播的潜在危险不明，很难预测和控制；羊等反刍动物，传播的潜在危险不明，很难预测和控制；5. 感染途径多感染途径多已知有消化道（食入）、神经、血液均可感染已知有消化道（食入）、神经、血液均可感染； 由正常由正常PrPc转化成恶性转化成恶性PrPsc的机理和因素不清，难以预防；的机理和因素不清，难以预防；6. 100%病死率，缺乏治疗药物，无法研制预防疫苗；病死率，缺乏治疗药物，无法研制预防疫苗；7. 异种间朊病毒感染，受感染动物体内的朊病毒为该种特异的异种间朊病毒感染，受感染动物体内的

26、朊病毒为该种特异的朊病毒。朊病毒。 朊病毒的特殊性质朊病毒的特殊性质第88页/共102页1.羊瘙痒病（羊瘙痒病（scrapie）2.疯牛病（疯牛病（bovine spongiform encephalopathy, BSE ）3.库鲁病（库鲁病（Kuru）4.克克-雅氏症（雅氏症（Creutzefeldt-jakob disease, CJD） 传染性病毒性痴呆（传染性病毒性痴呆（transmissible virus dementia, TVD）5.致死性家族性失眠症（致死性家族性失眠症（fatal familial insomnia, FFI）6.吉斯特曼吉斯特曼-斯召斯列综合征（斯召斯列

27、综合征（Gerstmann-Straussler syndrome, GSS）朊病毒感染引起人和动物的主要疾朊病毒感染引起人和动物的主要疾病病第89页/共102页中枢神经系统进行性退行性海绵样病变中枢神经系统进行性退行性海绵样病变, 四大神经病理特征：四大神经病理特征：1.神经元细胞空泡变性或海绵样变（神经元细胞空泡变性或海绵样变（Spongiform changes）2.神经元退化、丢失神经元退化、丢失(Neuron loss)3.星形细胞增生（星形细胞增生（Astrocytosis），取代正常的神经元细），取代正常的神经元细胞胞4.形成淀粉样斑沉积形成淀粉样斑沉积(Amyloidosis)

28、朊病毒病的共同病理特点朊病毒病的共同病理特点第90页/共102页朊病毒的分子特征朊病毒的分子特征The characteristics of the PrP molecule 人类人类PrP基因位于第基因位于第20号染色体。号染色体。mRNA转译转译出出253个个aa长的多肽链。多肽氨基端含长的多肽链。多肽氨基端含5个八肽重个八肽重复序列，两个糖基化位点，及一个二硫键。复序列，两个糖基化位点，及一个二硫键。PrPc结构中含有结构中含有3个个-螺旋结构，两个反向平行的螺旋结构，两个反向平行的-片片层结构。多肽链羧基末端的磷脂酰肌醇使朊蛋白层结构。多肽链羧基末端的磷脂酰肌醇使朊蛋白附着在细胞膜表面

29、。附着在细胞膜表面。第91页/共102页PrPc与与PrPsc分子结构特征比较分子结构特征比较PrPc二级结构中主要以二级结构中主要以-螺旋结构为主，约占螺旋结构为主，约占40%，仅存在少量仅存在少量-片层结构。溶解于非变性剂溶液，对蛋片层结构。溶解于非变性剂溶液，对蛋白酶白酶K敏感。敏感。2. PrPsc含有含有50%的的-片层结构，片层结构，20%的的-螺旋。不溶于螺旋。不溶于非变性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是在非变性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是在氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性的氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性的PrP2730。第92页/共102页羊瘙痒病羊瘙痒病PrPC与与PrPSC的三维结构的三维结构PrP