a-淀粉酶高产菌株筛选实验

1、恥淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化枯草芽孑包杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微 黃色，在液体培养基屮生长时，常形成皱嗓。需氧菌。可利川蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究屮 应用广泛。其芽抱0.60. 9x1.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孑包形成后菌体不膨 大。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。广泛牛k在中性的的含淀粉多的 环境中，如富含淀粉的而粉厂、土壤等。淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于而包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、 造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族

2、包括。-淀粉酶、3 -淀粉晦和衙 萄糖淀粉臨。a-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的a - 1, 4糖肯键，而使淀粉牛 成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。p-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。制 萄糖淀粉酶是一种作用于a - 1, 4糖昔键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化 可以很好的解决这一问题，其中q -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。另可尝试探索用一 定浓度的凝胶包埋枯草芽葩菌或用吸附法、交联法将枯草芽抱杆菌固定化，使菌体不能流动而酶对以存 在反应液里。凝

3、胶柱底部对选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物对以流出。【实验一】一、a淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选二、【实验原理】大多数枯草芽抱杆菌好氧，最适生长温度为32°c,pi【为7.2,转速为140r/min,接种量为9%,芽 泡率生长最适温度36°c,最适ph为7. 2,最适转速120r/mino在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线 法分离纯化出产a淀粉酶的菌株，根据是否町产生透明圈來筛选。透明圈越大，产酶能力越强。三、【实验仪器和材料】1、试剂：0.1%吕氏（loeffler）美蓝染液配制方法:a液：美蓝（methylene blue,又名甲烯蓝）0.3

4、 g, 95%乙醇30 ml；b 液：0.01% koh looml混合a液和b液即成，根据需要对配制成稀释美蓝液。2、淀粉酶筛选富集培养液（细菌）淀粉10 g、硫酸镀10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸轼二钾1 g、牛肉膏1 g,定容1 l,调 至pll为7,取300ml分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 °c, 20 min。3、淀粉酶筛选培养基i （细菌）淀粉3g、硫酸钱3g、氯化钠1.5g,用无机酸碱调ph值至7.0左右，加蒸憎水定容至300 ml,再加 琼脂5.4g,装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 °c, 20

5、 min,冷却至50-55°c 左右时倒入无菌平皿。4、淀粉酶筛选培养基ii （细菌）淀粉10 g、硫酸镀10 g.氯化钠5 £、硫酸亚铁0.5 磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g,定容1 l,调 至ph为7,再加18g琼脂，取300ml分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 °c, 20 min。5、器材烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片四、【实验步骤】1、富集培养（第1大丿：取标本于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm,摇晃5 min,取出后 稍静置。用无

6、菌枪头吸収上清液lml接入9 ml的富集培养液中，同时做一个不接菌液的空白对 照管一起培养。置30°c培养箱中培养2024小时（笫2, 3久9。2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片屮央的0.1%美蓝染色液屮，混匀后加盖玻片 制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从 而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。（第2犬）水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴 水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。3、镜检：取少许富集的菌液观察菌的形态。（第2q4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5 ml富集

7、菌液，加入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸儿 次，让菌液混合均匀，稀释成10"稀释液。再用1ml无菌枪头，吸取10“稀释液0.5 ml,移入装 有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸混匀，即成io-?稀释液。同样做法再一次，做成10；稀释液。5、倒平板培养a9：倒筛选培养皋i平板，凝固待川。川无菌枪头分别吸取102、1（）-3 浓度的稀释液0.1 ml于平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。平放桌而30 min,使菌液 渗透入培养皋内，然后将平板倒转，置3（）32 °c再培养24 h或稍长（过长则霉菌长出）（第3, 4 天丿。6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的大的透

8、明圈菌落，用接种环挑取一环的菌，在 筛选培养基i平板中采用划线分离法分离菌。并同时制片做纯度检查。若不纯，应进一步挑取该 菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。涂片镜检，菌落观察。（笫4, 5大）7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于筛选斜而培养基上培养（从第6步中的每个平板保藏 810株），待长好后置于冰箱内4 °c下保存。（第4, 5天）8、将保藏的菌株接种到筛选培养基ii平板屮，每个板接810株，培养1-2天后，选择4-5 株高产菌株保藏备份并分别进行摇瓶培养，进行酶活测定。五、酚活测定方法（1）dns 法筛选出高晦活菌株。标本本实验设定40 c时在5 min内水解淀粉释放1 m

9、g麦芽糖所需的悔量为1个 酶活力单位（u）。计算酶活力的公式为：酶活力单位二c梅x sx刀。式中馆为酶液中麦芽糖的浓度；煽为提取酶液的总体积；n为酶液的稀释倍数。利川麦芽糖梯度标准液绘制标准曲线，用spss 12.0统计软件包计算冋归方程，求出相关系数和标准误注：dns法测还原糖-dns-二硝基水杨酸dns即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（dns）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范吊i内颜色深浅与还原糖含量成 比例关系的原理，川比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没

10、有选择性，故dns方法适合川衣多糖(如纤维索、半纤维索和淀粉等)水解产生的 多种还原糖体系中。dns法测还原糖- dns试剂的制备将6. 3克dns和262ml 2mol/l氢氧化钠,加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中,再加上5 克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml,即制成3, 5-二硝基水杨酸试剂，贮于 棕色瓶中备用。dns法测还原糖-葡萄糖标准曲线的绘制分别取葡萄糖标准液(lmg/ml) 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25 ml试管中,分别准确加入d ns试剂2ml,沸水浴加热2min,流水冷却，用水补足到15ml刻度。在54onm

11、波长下测定吸光度。dns法测还原糖-样品的测定样品液适当稀释,使糖浓度为0. l-l.omg/ml,取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中,加dns试 剂2.0ml,沸水煮沸2min,冷却后用水补足到15ml刻度,在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线査出 葡萄糖mg/inl数。求出样品中糖含量。六、【注意事项】1、美兰染色浓度和时间严格掌握；2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。【实验二】二、菌株的鉴定一、【实验目的】学习酵母菌的鉴定方法，熟悉使用分子牛物学手段进行微牛物鉴定。二、【实验原理】微生物鉴定是科研及生产过程中非常重要的工作。可以通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子

12、生物学手段进行鉴定。三、【实验仪器和材料】a、dna提取需要配置的试剂高盐的te buffer配制5（） ml0.5 ml（lm 母液）0.01 ml（0.5m 母液）终浓度10 mm tris.cl, ph &o0mm edta, ph 8.0室温可保存几年ctab提取液终浓度配制200 ml2%（w/v） ctab100 nim tris.cl, ph&o4g20 ml（ 1 m 母液）20 mm edta, ph&o10.22 g1.4mnacl室温可保存儿年loxctab/nacl 溶液（i0%ctab/0.7 m nacl）在80 ml h2o中溶解4.1 g

13、nacl,缓慢加入10 gctab,同时加热并搅拌。如果需要,可加热 至65°c溶解。定容至100 ml其它化学试剂：异内醇、乙醇、液氮、taq酶、dntps、引物。b、仪器移液枪（10、100、1000）11） ,0.2 ml pcr 管，枪头，2 ml eppendorf 管，饭盒。四、【实验步骤】1 形态学鉴定：（第7天）a. 菌落形态观察按普通微牛物实验指导书观察所分离的细菌菌落特征。b. 细胞形态学观察按普通微牛物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。2.分子生物学鉴定：（1）菌体dna的提取（ctab法捉取真菌基因组dna）（第7,8天）1）取

14、少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵屮，加入液氮粉碎，然后加入800 pl 2% 65°c保温的2xctab抽提液，混匀，65°c保温3060 min。2）加入800 pl的氯仿/异戊醇（24： 1）,轻缓颠倒混匀，1000（） r/min,离心5 min。3）取上清（约600 |11）,加入1/10体积（约60卩1）的65°c的ctab/nacl溶液,颠倒混匀。4）用等体积（约600111）的氯仿/异戊醇（24： 1）抽提,10000 r/min,离心5 min。5）取上清（约450卩1）,加入0.8 v的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做 下步，

15、否则，20°c保温1020 min）。6）4°c, 12000 r/min,离心 10 min。7）去上清，用高盐的te buffer重悬（约100卩1）。可65°c保温30 min,至大部分溶解）。8）加入0.8体积的异内醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀,-20°c保温10-20 min）, 4°c, 12000 r/min,离心 15 min。9）去上淸，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的te buffer重悬（3060卩1）。（2）dna质量检测（第入帚心以1%琼脂糖凝胶电泳检测棊因组dna人小及提取质量;紫外分光光度计法检测dna纯

16、度(将dna 稀释50倍后分别测od26()和od280，并计算od26()/od28()的比值)。dna浓度计算：(3) pcr扩增c第9天丿核糖体dna普遍存在于生物屮，真核生物的核糖体rna中包插26s、18s、5.8s和5s 4种不同沉降系数的核糖体rna片段，它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性，同时由于各 种原因具有一定的突变，使它们作为-种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。早期一般选収大小 适中的18s序列作为鉴定的标准，随后26s的d1/d2区序列和its序列也被用于应用于鉴定工作 中(图1)。木实验使用its序列进行鉴定，包括its1和its2两个转录间隔区。p

17、cr反应引物使用 its1(5'tccgtaggtgaacctgcgg3')和 its4 (5,-tcctccgcttattgatatgc-3, )o18s5.8s26s5swits1 its2tigsligs2图1真核生物钟编码核糖体的序列(5i 3j 取一 pcr管，按卜述pcr体系加入pcr扩增所需的试剂：ddh2o34.6 plloxpcr buffe(withoih mgcb)5 plmgcl2(25mm)4 pldntp(lomm)lpl5'prime" 1() mm)2 pl3'primer(l() mm)2 pltemplate (50

18、 -500 ng/pl)lpltaq dna polymerase(5u/gl)0.4 pltotal50 pl将上述加样后的pcr管放到小离心机低速甩一下，放入pcr扩增仪进行扩增。扩增反应程序按如 下设定：94°c预变性5 min94°c变性30 sec52°c退火30 sec40个循环l72°c延伸60 sec丿72°c延伸5 min4°c保温(到达此温度时停止pcr扩增，将pcr管取出)(4) pcr扩増检测以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增是否有所想要的大小的目标条带，人概浓度如何。(5)测序将符合要求的样品(选5-6个

19、)，按公司测序订单要求填写。(测序一般可以分为将pcr扩展h标dna连接到t载体上和直接利川pcr产物测序两种方法，木方法采川直接利川pcr产物测序，需要自己捉供测序引物)(6)生物信息学分析方法演示(第10大丿使用软件bioedit除去测序不口j靠部分及无用的部分，然后登陆ncbi网站，进行在线比対分析。五、【注意事项】1. pcr扩增时pcr反应缓冲液，特定公司的特种型号的taq酶会自带自己所需的pcr反应 缓冲液，不同的公司的产品（taqlw与pcr反应缓冲液）z间一燉不可以混用；2. 观察pcr反应缓冲液是否包含mg?*,如杲包含，则不需要另加入；如杲不包含，则必须 加入。六、【思考题

20、】进行微生物物种鉴定时为什么使川不同的鉴定方法综合进行鉴定？【实验三】诱变育种进行诱变后，计算致死率，并进行筛选，同时用原始菌株做产酶能力对照。【实验四】四、淀粉酶的固定化技术一、实验目的和原理廿的：学会交联法制备固定化卿的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂衣酶分子间，酶分子与惰性蛋白间, 或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。 交联剂为戊二醸，载体为甲壳素。二、实验器材1. 恒温水浴锅2. 恒温振摇仪三、实验试剂1. 5%戊二醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘1.1g。碘化钾2.2g, 于小烧杯中，加10ml蒸

21、镭水使之溶解，然后转入容量瓶 中。再加少量的蒸徭水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶屮，最后定容至50ml摇均后放于棕色试管 中备用。4比色稀碘液：取碘原液2ml,加碘化钾20g,再用蒸馆冰定容至5000ml。5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量熬徭水做成悬浮液。然后在搅拌卞注入 沸腾的蒸憎水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸憎水定容至100mlo6. ph6磷酸氢二钠一一柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠(na2hpo4.12h2o) 45.23g,柠檬酸(ceh* o7.h2o) 8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000mlo7. 标准终点色溶液,a液:精确

22、称取氯化钻(coci.6h20) 40.2493g和重洛酸钾(k2gro7) 0.48 78g,川熬馆水定容至500ml.b液:：精确称取络黑t40mg,用蒸谓水定容至100ml.同时取a液40ml、b液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。四、实验操作(一)酶液的制备精确称取a 淀粉酶2g,先用少量40°cph6的磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液溶解, 溶解过程屮轻轻川玻璃棒捣研。将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少童上述缓冲液，如 此反复捣研34次。最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过 滤，溶液供测定使用。(二)固定化酶的制备1.称取50mg粉末甲壳素，加入5%戊二醛10ml,调节ph=8.5,搅拌均匀后，于25°c,恒温振摇1小时。取出后，倾去戊二醛，然后以蒸徭水洗涤，倾去清夜,以除去多余的交联剂。2.取前面制备的酶液10ml, 上述处理的卬壳素混合均匀，25°c,恒温振摇1小