DNA测序 化学降解法

1、.DNA序列测定序列测定.脱氧核糖含氮碱基磷酸A G C TDNA的基本单位腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶. DNA测序：测定未知序列 确定重组DNA的方向与结构 对突变进行定位和鉴定 比较研究.成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。同一时期, Sanger发明了双脱氧链终止法 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代这些技术统称为第一代DNADNA测序技术。测序技术。.第二代测序技术第二代测序技术.三种第二代测序技术对比三种第二代测序技术对比测序技术4544

2、54SolexaSolexaSOLiDSOLiD上市时间200520072007价格（万美元，2007）504559单次反应数据量0.42050读长（bp）40050*250优势长读长低测序成本，高性价比高通量，高准确度.第三代测序技术第三代测序技术 第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。 .Maxam-Gilbert DNA 化学降解法化学降解法基本原理：直接或间接特异性识别

3、4 种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5或3)打断磷酸二酯键将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。操作步骤 将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序. 先用限制性内切酶把DNA切成10200bp 的测序材料； 用碱性磷

4、酸化酶处理该片段，消除5末端上的磷酸； 在5OH端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； 标记片段变性为单链； 用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段， 产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段； 经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出.该反应的关键在于使该反应的关键在于使DNA的的4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有1-2种发生特种发生特异性的化学切割反应：异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；修饰的碱基从核糖环上转移；失去

5、碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。 . 肼，又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。 如果加入高浓度的盐（1.5M NaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。 在高温强碱作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱哌啶甲酸(90,1mol/L)在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂 胞嘧啶胸腺嘧啶. 硫酸二甲酯dimethyl sulphate ，DM

6、S ，（CH3O）2SO2： 一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N甲基化，但是鸟嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。热哌啶：使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。.DNA化学降解反应体系化学降解反应体系反应体系反应体系 碱基修饰试剂碱基修饰试剂 碱基修饰反应碱基修饰反应 主链断裂试剂主链断裂试剂 断裂点断裂点G 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶六氢吡啶 GG+A 甲酸甲酸 脱嘌呤作用脱嘌呤作用

7、 六氢吡啶六氢吡啶 G和和AC+T 肼肼 嘧啶开环嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C和和TC 肼（加盐）肼（加盐） 胞嘧啶开环胞嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在（硫酸二甲酯）在中性中性pH环境，主要环境，主要作用于作用于G，被六氢吡啶作用而造成该，被六氢吡啶作用而造成该位点上位点上DNA链的断裂。链的断裂。 甲酸甲酸具有脱嘌呤作用。具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点链在脱嘌呤位点(G和和A)发生断裂。发生断裂。 肼肼，在，在碱性条件下，作用于碱性条件下，作用于T胸腺嘧啶和胸腺嘧啶和C胞嘧啶胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生导致

8、在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的高浓度的盐盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于C胞嘧啶胞嘧啶。A C 肼肼 90C, NaOH (1.2M) 断裂反应. 在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机的机制是：制是： G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。然后哌啶置换了

9、嘌呤。 G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开甲基化，其后断开了了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。. 在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：的机制是： G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原

10、子质子化，削弱了嘌呤脱（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开了甲基化，其后断开了C8-C9间间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰才能与肼发生反应，随后

11、，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。的胞嘧啶被哌啶置换。.哌啶.5 GATCACTACTG 3 标记标记5 *GATCACTACTG 3 G：DMSC：肼（加盐）：肼（加盐）G+A：甲酸：甲酸C+T：肼：肼5-*GATCACTACTG 5-*G G5-*GATCACTACTG 5-*GATCACTA 5-*GATCA5-*GA 5-*G 5-*GATCACTAC 5-*GATCACT 5-*GATCAC5-*GATC 5-*GAT 5-*GATCACTACT 5-*GATCACTACTG- 5-*GATCACTAC 5-*GATCAC5-*GATC -*GATCACTACTG- .在化学修饰反应过程中

12、，通过在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间控制反应温度和反应时间，只有只有一小部分碱基被修饰一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰而不是全部被修饰)，随后进，随后进行的断裂反应也是行的断裂反应也是定量反应定量反应。因此，。因此，DNA链并不是在所链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂随机断裂。在。在4个反应个反应中，产生中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。段。只有带标记末端的片段可被识别只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的，没有标记末端的片段可以忽略不计。片段可以忽略不计。.、

13、 在化学修饰反应过程中，通过在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间控制反应温度和反应时间，只有，只有一小一小部分碱基被修饰部分碱基被修饰(而不是全部被修饰而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是，随后进行的断裂反应也是定量反定量反应应。因此，。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机随机断裂断裂。在。在4个反应中，产生个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。片段。只有带标记末端的片段可被识别只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略，没有标记末端的片段

14、可以忽略不计。不计。.电泳和读谱电泳和读谱具体的测定过程中，首先将3端或5端的双链DNA溶解在总体积为50L的、分别含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/L EDTA、0.05%二甲苯蓝和0.05%溴甲酚蓝的溶液中，使双链DNA变性。然后加到由5%10%的丙烯酰胺、0.16%0.33%的双丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/L EDTA组成的凝胶板上，进行电泳和放射性自显影等处理，制得一端带标记的单链DNA。.电泳检测电泳检测-310.步骤：毛细管灌胶.步骤：样品盘移动.步骤：电进样及电泳.步骤：荧光激发及检测.化学法读序的方法化学法读序的方法

15、化学法测序放射自显影图谱的识读，比较复杂一些，这是因为化学裂化学法测序放射自显影图谱的识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或或5条垂直的阶梯带，条垂直的阶梯带，AC反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和和C+T两列中含两列中含有所有相差一个碱基的有所有相差一个碱基的DNA片段。片段。如果如果G+A中出现中出现1条带就看条带就看G列中是否列中是否有同样大小的带，若有即为有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为碱基，无则为A碱基；同理，碱基；同理，C+T中则检

16、查中则检查C列中有无同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C，无则为，无则为T。在做了在做了AC反应时，出现反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为较深的带时，可以帮助确定为A碱基。化学法必须碱基。化学法必须4或或5个反应管统一阅读，个反应管统一阅读，DNA中中4个碱基每个位置都有个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测的个相应的片段，待测的DNA全部序列可直全部序列可直接读出。接读出。 化学法测序采用化学法测序采用32P标记标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可

17、靠序列数量约为200-300bp以内。以内。.聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳将泳将DNADNA链按长短链按长短分开分开, ,根据放射自根据放射自显影显示区带，直显影显示区带，直接读出接读出DNADNA的核苷的核苷酸序列。酸序列。如果如果G+A中出现中出现1条带就看条带就看G列中是列中是否有同样大小的带，否有同样大小的带，若有即为若有即为G碱基，碱基，无则为无则为A碱基；同碱基；同理，理，C+T中则检查中则检查C列中有无同样大列中有无同样大小条带，有即为小条带，有即为C，无则为无则为T。.在做了在做了AC反应反应时，出现时，出现较深的带较深的带时，可以时，可以帮助确定帮助确定为为A碱基。碱基。.DNA序列测定的应用序列测定的应用1) 测序测序 PCR克隆测序验证 突变体检测 新基因测序 全基因组测序 系统发育及物种鉴定2) 2) 片段分离片段分离 个体识别：亲缘鉴定 SNP关联分析 疾病诊断等.Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度约250bp 优点：不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的 DNA 片段可