分步酶解制备花生短肽的研究

1、分步酶解制备花生短肽的研究第24卷第5期2008年5月农业工程TransactionsoftheCSAEV_01.24No.5May2008275分步酶解制备花生短肽的研究张宇昊,王强,(1.西南大学食品科学学院,重庆400715;2.周素梅2,马良中国农业科院农产品加工研究所,北京100094)摘要:为了高效制备花生短肽,在花生蛋白Alcalase酶水解的研究基础上,进一步采用N120P酶水解花生蛋白并对各种影响因素进行了系统地研究;建立了短肽得率与各种影响因素的回归模型;确定出了N120P继续酶解花生蛋白Alcalase酶解物制备花生短肽的最佳工艺参数为pH值6.0,水解时间65min,水

2、解温度57C,酶与底物比2061U/g,.在此条件作用下,体系中短肽得率为89.01%,比Alcalase单独酶解提高10.86个百分点;水解度为23.76%,平均肽链长度为4.21.经高效液相色谱测定,大部分水解产物的相对分子质量小于1000.关键词:花生蛋白;分步酶解;花生短肽;制备中图分类号:TS201.25;TS201.1;TS229文献标识码:A文章编号:1002-6819(2008)-5-0275-05张宇昊,王强,周素梅,等.分步酶解制备花生短肽的研究J.农业工程,2008,24(5):275-279.ZhangYuhao,WangQiang,ZhouSumei,eta1.Pre

3、parationofpeanutfunctionaloligopeptidesbytwo-step-hydrolysisJ】TransactionsoftheCSAE,2008,24(5):275-279.(inChinesewithEnglishabstract)0引言花生是中国六大油料作物之一,产量高居世界首位【1】.目前,中国对花生的利用多在食用油脂方面,对花生蛋白的利用较少.花生蛋白中氨基酸分布广泛,含有人体必需的8种氨基酸中,除蛋氨酸含量较低外,赖氨酸,色氨酸,苏氨酸含量均接近联合国粮农组织所规定的标准【2】,属于完全蛋白.所以如何进一步开发和利用花生蛋白资源,生产高附加值产品成为一

4、个重要的课题.现代营养研究表明3,41:相对分子质量低于1000的短肽极易被吸收,且具有较强的生物活性和功能特性.在中国大豆肽生产已经实现产业化,但是如何在短时间内获得高水解度,高得率的功能性短肽仍是其生产工艺中需要解决的一大难题,因此,如何利用花生蛋白制备花生短肽,成了一个急需解决的技术问题.张新会L5采用Alcalase酶水解大豆蛋白,水解时间为240min,所得酶解液水解度为14.5%;谭斌等【6】采用AS1.398中性蛋白酶作用于花生蛋白,水解360min,酸溶性花生肽得率为89.76%;黎观宏【17等用Alcalase水解花生蛋白240min,水解度为18%,莫琪】采用木瓜蛋白酶水解

5、花生蛋白960min,三氯乙酸(Trichloroaceticacid.TCA)可溶性氮含量为81.73%.吴建中I9】采用Alcalase水解大豆蛋白,水解时间为300min,所得酶解液水解度为12.7%,TCA可溶性氮含量为70%,采用Protamex酶继续Alcalase酶作用2h,水解度可增至16%.由此可见采用单酶水解很难在短时间内获得高水解度高得率的功能性短肽,而采用两种蛋白酶分步酶解可提高短肽的得收稿日期:200708-07修订日期:20080505基金项目:国家十一五科技支撑计划(2006BAK02A07-2)作者简介:张宇吴(1978一),男,副教授,博士,主要从事生物活性肽

6、方面研究.重庆西南大学食品科学学院,400715.Email:zhyl203tom.tom通讯作者:王强(1965一),男,研究员,主要从事功能食品加工和全程质量控制方面研究.北京中国农业科院农产品加工研究所,100094率和水解度.因此,选择合适的蛋白酶对蛋白进行分步酶解并优化作用条件是实现短时间内获得高水解度高得率功能性短肽的有效途径之一.N120P酶是由选育出的芽孢杆菌生产而得,主要作用于丙氨酸,缬氨酸以及芳香族氨基酸等参与组成的肽键.本研究以低变性花生粕为原料,在花生蛋白Alcalase水解的研究基础上,利用N120P酶继续Alcalase酶水解花生蛋白制备花生短肽,对进一步酶解工艺中

7、的多种影响因素进行了研究,探索出了分步酶水解花生蛋白的最适工艺参数,可以在较短时间内进一步提高花生短肽的得率并降低其分子量分布,为花生功能性短肽的产业化提供理论和技术依据.1材料与方法1.1主要原料和试剂花生蛋白原粉:冷榨花生粕粉碎,过120目筛制得(青岛长寿);Alcalase(酶活力1.214x10U/g,N0V0公司);N120P(酶活力1.2×10U/g,Kerry公司);福林一酚试剂(Sigma公司);细胞色素C(Sigma公司);杆菌酶(Sigma公司);乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸(Sigma公司);乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(Sigma公司);其他试剂均为分析纯.1.2

8、主要设备KIELETECANALYSISER全自动凯氏定氮仪(瑞典Foss公司);SoxtecAvanti2050自动索氏总脂肪分析系统(瑞典Foss公司);CS501.SP超级数显恒温器(重庆四达试验仪器),UV-1201紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);Waters600高效液相色谱仪(Waters公司);TSKgel2000SWXL色谱柱(Tosho公司).1.3分析方法1)花生蛋白原粉中各组分的测定:蛋白质测定,按GB/T5009,5.2003进行;水分测定,按GB/T5009,3.2003进行;脂肪测定,按GB/T5009,6.2003进行;灰分测定,276农业工程2008住按

9、GB/T5009,4-2003进行;总糖测定,苯酚.硫酸法【】们.2)蛋白酶活力的测定:改进的Folin.酚法】.3)可溶性氮的测定:Folin.酚法12.4)短肽得率测定:三氯乙酸可溶性氮法"】TCANSI:×100No式中TCA.三氯乙酸可溶性氮得率,%;M在10%TCA中可溶性氮,mg;0一原料中总氮,mg.5)水解度()的测定:邻苯二甲醛(OPA)法【HJ.6)平均肽链长度(尸c己)测定:PCL:DH7)花生功能性短肽分子质量分布的测定采用高效液相色谱(HPLC)对酶解物的分子量分布进行分析,条件为:色谱柱:TSKgel2000SWXL300IIlIn×7

10、.8rlllil流动相:乙腈/水/三氟乙酸为45/55/0.1(v,厂);检测波长:220砌;流速:0.5mL/min;柱温:30;分子质量参照物分别为细胞色素C(相对分子量12500),杆菌酶(相对分子质量1450),乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸(相对分子质量451),乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(相对分子质量189).1.4试验方法1.4.1冷榨花生蛋白原粉的预处理花生蛋白原粉-÷碱溶(料水比l:10,25,25min,pH8.5)-÷离心(800xg,5min)上层清液叶酸沉(pH4.5)-÷离心(4200xg,15min)-÷冷冻干燥【】.1.4.2

11、Alcalase酶对花生蛋白的酶解Alcalase酶对花生蛋白的酶解条件为水解温度54,底物浓度4%,酶底物比3480U/g,pH值8.0,水解时间107min嗣.1.4.3N120P酶单因素酶解试验基于Kerry公司推荐N120P酶作用条件以及Alcalase酶对花生蛋白酶解的参数优化结果确定N120P单因素试验的条件.固定花生蛋白浓度为4%,其他因素基本条件为定为:N120P酶用量1200U/g,pH6.0,反应温度55C,水解时间180min.改变其中一个条件,固定其它条件以分别考察酶用量,pH值,反应温度和反应时间对TCA-NSI和的影响.反应结束后90水浴15rain灭酶,定容250

12、mL,测TCA.NSI和DH.各因素浓度梯度分别为:酶用量:300,600,1200,1800,2400,3000,3600U;pH值5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0;反应温度:40,45,50,55,60,65,70,75;反应时间:0,5,20,60,120,180,240min.1.4.4均匀试验设计根据单因素试验结果,N120P酶作用pH值固定为6.0,着重研究用N120P进一步酶解花生蛋白Alcalase水解物过程中酶底物比,水解温度,水解时间3个因素,通过单因素试验确定三因素的取值水平范围,以TCA-NSI为指标,选用均匀试验设计进行研究,以确定最佳分步酶解条

13、件组合.试验因素水平编码表见表1.表1均匀试验设计的因素水平Table1Factorsandlevelsofunifonnly-designedexperiment1.4.6花生蛋白分步酶解液DH的测定配制4%的花生蛋白溶液,先以Alcalase酶解,之后调整体系pH值至6.0,加入N120P酶解,条件为水解温度57,酶与底物比为2061U/g,水解时间65inin90"c水浴15rain灭酶,测定酶解液的DH和平均肽链长(PCL).2结果与分析2.1花生蛋白粉组成花生蛋白粉组成见表2,其中除含有51.8%的蛋白质外,还含有大量多糖和脂肪,这些物质的存在会影响花生短肽产品的纯度和品质

14、,因此分步酶解前必须通过预处理对花生蛋白进行纯化.表2花生蛋白粉的组成Table2Componentsofpeanutproteinpowder2.2Alcalase对花生蛋白的酶解在Alcalase对花生蛋白的最佳酶解条件下,体系TCA-NSI为(78.15_+1.129)%,DH为(17.52±0.71)%,平均肽链长度(PCL)为5.71+N120P水解花生蛋白的单因素试验2.3.1酶用量对水解的影响试验分析了N120P酶浓度从3603600U/g范围内体系TCA-NSI和DH的变化,结果表明(图1),随着N120P酶用量的增加,酶解液中的TCA-NSI和DH逐

15、渐上升.当N120P酶用量小于1800U/g时,TCA-NSI与DH上升速度较快,当N120P酶用量达到1800U/g时,TCA-NSI和DH分别为(54.44+0.42)%和(13.89+0.44)%且当酶用量在18003600U/g范围内TCA-NSI和DH上升幅度仅为1.17%和0.707%.根据酶动力学u,酶的用量过多或过少均对水解不利,过多不仅达不到水解效果,还造成资源量费.因此较适加酶量应在1800U/g左右.2.3.2酸碱度对水解的影响酸碱度对酶促反应的影响,主要体现在对酶活力的第5期张宇吴等:分步酶解制备花生短肽的研究277影响.试验分析了pH值58范围内体系TCA-NSI和D

16、H的变化.结果如图2所示,随着pH值的升高,TCA-NSI和DH逐渐增大,当pH6.0时的TCANSI和DH达到最高值,分别为(51.940.42)%和(13.830.34)%,当pH大于6.0时,TCA-NSI和DH开始下降.可见体系过酸或过碱都会影响酶的活性,N120P酶更适合于中性偏酸的条件,因此选择pH6.0作为最佳pH值.57.055.554.052.551.049.5年48.046.545.043.542.040.539.005001000150020002500300035004000酶量/u?注:花生蛋白浓度4%,pH6.0,反应温度55C,水解时间180min图1N120P用

17、量对水解的影响Fig.1EffectofN120Pdosageonhydrolysis蕈委5.05.56.06.5,.0,.5OpH值注:花生蛋白浓度4%,N120P用量1200u,反应温度55C,水解时间180min图2pH值对水解的影响Fig.2EffectofpHvalueonhydrolysis2.3.3反应温度对水解的影响酶的活性很大程度上取决于反应体系的温度.本试验分析了从4075C这个温度范围内TCA-NSI和D的变化.结果如图3所示,当温度由40C升至55过程中体系的TCA-NSI和DH大大提高,在5560时体系TCA-NSI和DH达到最大值,分别为(53.29+1.48)%和

18、(13.97±0.56)%,超过60后体系TCANSI和DH又开始下降.这是因为【l8蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构,若反应温度超过某一限度,分子吸收了过多的能量,引起次级键解体,将丧失或部分丧失催化活性.因此较佳的作用温度可以在55到60之间.2.3.4水解时间对水解的影响试验分析了0240min范围内的不同酶解时间对体系TCA-NSI和DH的影响.由图4可知,在酶解的前20min,TCA-NSI和DH上升非常迅速,20min以后,上升速度开始放缓,60min时TCA-NSI和DH分别达U(48.99+1.34)%和(12.80.37)%.而当酶解时间在60240min范围内,

19、TCANSI和DH上升幅度仅为2.92%和1.21%,增幅很不明显,因此较适的作用时间在60min左右.詈童4045505560657075温度/C注:花生蛋白浓度4%,N120P用量1200U/g,pH6.0,水解时间180min图3温度对水解的影响Fig.3EffectoftemperatureOilhydrolysis14着4-24-2002040608o100120140160180200220240时间/min注:花生蛋白浓度4%,N120P用量1200U/g,pH6.0,反应温度55C图4时间对水解的影响Fig.4Effectofhydrolysistimeonhydrolysis

20、2.4N120P酶水解花生蛋白的均匀设计通过均匀设计的11个处理组合试验测得的TCA-NSI的结果见表3.用DPS工作平台对结果进行分析处理,建立TCA-NSI与各因素关系的数学模型,并通过对模型分析而获得最佳的工艺条件.表3均匀设计试验结果Table3Resultsofuniformly-designedexperiment处理号时间蜀温度酶用量TCA-NSI(/%84.0081.2377.7985.4083.7778.4784.0081-2388.2185.1785.40注花生蛋白浓度4%,pH6.0.zo"HB¨m98如骢铊粥器zo0505050505050HH

21、68;¨mm卯如5rrz.u1LfHo"HB¨980505050505骢姐钇¨42加51897366193¨48275579648321n123456789n278农业工程2008年对试验结果进行二次多项式逐步回归分析,以回归模型的复相关系数为指标,半自动地删除方程中不显着的相,最终得到回归模型为:Y-67.852+2.450X2+4.48-0.057x-0.143X2-0.273+o.045XIX30.172X2X3回归模型相关系数R=0.98269,P=0.0328,方程Durbin-Watson统计量d=-I.76122687,说明残差相

22、互独立.因此本试验建立的回归模型可信.根据回归模型得到TCA-NSI最高时的优化组合为=2.81124,x2:4.31006,x3=7.08699.即水解时间65min,水解温度57,酶底比为2061U/g,最优组合同单因素试验结果基本一致.在此条件下进行试验测得的TCA-NSI为89.01%,比Alcalase酶单独作用提高了10.86个百分点.2.5花生蛋白复合酶解液DH的测定花生蛋白在最优条件下进行分步酶解后,总酶解时间为172min,最终体系中水解度DH为(23.76+0.93)%,比Alcalase单酶水解提高了6.24个百分点;PCL为4.21+0:16,比Alcalase单酶水解

23、降低了1.5.由此可见,通过分步酶解可以大大提高花生功能性短肽的得率,极显着地降低花生功能性短肽体系的肽链长度(p<0.01).2.6花生功能性短肽的相对分子质量分布采用TskgelG2000SWxL凝胶柱对花生短肽相对分子质量进行分析,标准品回归方程为lgMw=7.180.239相关系数R=0.9925,式中一相对分子质量,出峰时间,由此可推出花生功能性短肽的相对分子质量.由图5可知,大部分花生功能性短肽相对分子质量在1000以下.0?6O00?200j'浸.茸一1.一u0005l0l5202530时间t/min图5花生功能性短肽的相对分子质量分布高效液相色谱图Fig.

24、5ChromatogramofmolecularweightdistributionofpeanutfunctionaloligopeptidedeterminedbyHigh-performanceLiquidChromatography(HPLC)肽类产品主要是以相对分子质量分布评定其等级标准,国际市场上相对分子质量分布小于10000的普通大豆肽产品价格在3.5万元/t,相对分子质量主要分布在1000以下的高纯度大豆肽粉市场价则达到20万元/t,可见低相对分子质量分布的植物肽具备极高的附加值.但是目前市场上并未见到相应的花生短肽产品.本研究使用N120P蛋白酶使花生蛋白的Alcalase水

25、解物的水解度显着提高,最终花生短肽产物分子量分布主要集中在1000以下,为高质量花生短肽的产业化打下了良好的基础.3结论1)N120P继续酶解花生蛋白Alcalase酶解产物,体系TCA-NSI与水解时间(),水解温度()及酶底比(X3)显着相关,建立了回归模型可信.2)确定了NI20P继续酶解花生蛋白Alcalase酶解产物的最佳工艺参数为水解时间65min,水解温度57,酶底物比2061U/g,.3)采用分步酶解制备花生功能性短肽,酶解时间为172rain,最终体系TCA-NSI为89.01%,DH为(23.76+0.93)%,PCL为4.21±0.16.4)HPLC测定结果显示

26、,通过分步酶解制备的花生功能性短肽大部分分子量在1000以下.参考文献1】刘志强,刘璧,曾云龙.酶法有限水解对花生蛋白功能特性的影响J】.食品科学,2004,25(1):6972.2】张宇吴,王强.花生蛋白的开发与利用J_花生,2005,34(4):1216.3GrimbleGK,SilkDBA.Intravenousproteinhydrolysates-TimetoturntheclockbackJ.ClinicalNutrition,1990,9(1):3945.4顿新鹏,陈正望.酶法水解米渣蛋白制备大米小分子肽J】.食品科学,2004,25(6);113116.5张新会.大豆肽的制备,

27、纯化级分级膜分离研究D.华南理工大学,20o2.6谭斌,曾凡坤,吴永娴.花生肽的酶法生产工业艺研究【J】.食品与机械,2000,77(3)-l4一l7.7黎观红,施用晖,乐国伟,等.花生分离蛋白碱性蛋白酶Alcalase水解物具有血管紧张素转化酶抑制活性【J】.食品科学,2005,26(6):55-60.8莫琪.木瓜蛋白酶水解花生粕蛋白的研究J】.粮食与饲料工业,1996,(12):3738.9】吴建中.大豆蛋白的酶法水解及产物抗氧化活性的研究D.华南理工大学,2002.10】DubisM.Colorimetricmethodfordeterminationofsugarandrelateds

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30、白制备花生短肽第5期张宇吴等:分步酶解制备花生短肽的研究279的研究J.农业工程,2007,23(4):258-263.17邓乾春,陈春艳,潘雪梅,等.白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性研究J】.农业工程,2005,21(11):155159.18】王梅,谷文英.酶解玉米黄粉蛋白制备可溶性肽J.粮油食品,1999,7(1):1-3.Preparationofpeanutfunctionaloligopeptidesbytwo-step-hydrolysisZhangYuhao,WangQiang,ZhouSumei,MaLiang(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.InstituteofAgroFoodScienceandTechnology,Chine