吡格列酮抗LPS模型小鼠抑郁表型的作用及其机制研究

1、吡格列酮抗LPS模型小鼠抑郁表型的作用及其机制研究第一部分吡格列酮抗抑郁作用的代谢组学研究及氧化应激验证目的 : 探讨LPS诱导小鼠抑郁模型中的病理生理学改变，并且通过结合行为学实验、代谢轮 廓分析及氧化应激相关指标检测,揭示PPARy激动剂PIO抗抑郁作用的可能机 制。方法:48只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,20-25g)单笼饲养于室温22± 2° C,12h昼夜节律(早上8点开灯)，自由摄食水。在适应性喂养一周、基线行为学测定(OFT,FST以及SPT)后,小鼠被随机分为三组:(1 )LPS 组，接受 LPS(1y L/ 只,i.c.v.)、NS(20 mL/k

2、g,i.g.) 处理;(2)LPS+PIO 组,接受 LPS(1y L/ 只,i.c.v.)、PIO(20mL/kg,i.g.) 处理;(3)对照组，接受 NS(1y L/ 只,i.c.v.)、NS(20 mL/kg,i.g.) 处理。LPS(血清型 0127:B8)和PIO分别以10ng/卩L和1 mg/mL的浓度溶于NS在LPS或NS侧脑室注射的2h前实行PIO或NS的灌胃处理。术后即刻称量 体重,并且进行术后24h内的SPT,随后进行24h后的OFT以及FST当行为学实验(n=14/组)结束后,立即处死小鼠、取出脑组织、分离海马用于 进一步的代谢轮廓分析(n=10只/组)、WB检测(n=

3、4只/组)。每组中2只小鼠接 受溴酚蓝染液注射以确保注射位置的准确性。采用GC-MSJ术进行三组中小鼠海马组织的代谢轮廓分析。运用多元统计分析,包括PCA PLS-DA和 OPLS-DAS行差异代谢物的鉴定。此外,采用7次循环交互验证和200次响应排序的RPT对OPLS-DA莫型进行 考察。OPLS-DA变量的重要性用 VIP法评价。运用IPA进行差异代谢物的相关分析,基于Ingenuity Knowledge Base数据 库中的信息 , 鉴定最具代表性的经典通路和分子互作网络。根据代谢轮廓分析的 结果,采用WE分析进行小鼠海马内氧化应激相关指标的进一步验证结果:1.PI0对接受中枢炎性应激

4、小鼠行为学改变的影响：中枢LPS注射诱导 小鼠抑郁样行为,包括快感缺失、行为绝望(表现为SPT中糖水偏好的下降、FST 中不动时间的延长)；同时伴有焦虑样行为(表现为OFT中中心活动距离的下降) 以及急性病样反应，包括探索性活动、自主活动的降低(表现为OFT中直立次数、 总活动距离的下降),这些改变被PIO预处理不同程度地逆转。然而，作为急性病 样反应中负能量平衡的结果 ,PIO 预处理未能改变体重的降低。总之，这些结果表明PIO预处理可逆转侧脑室LPS注射诱导的小鼠抑郁样、 焦虑样行为以及某些急性病样反应。2.基于GC-MS勺小鼠海马代谢轮廓分析:(1) 在 TIC 色谱图中的色谱峰代表相应

5、的代谢物 , 并且通过峰面积归一化法确定他们 的相对浓度。本研究中 , 三组海马组织代表性 TIC 色谱图的分析信号强 , 峰容量大 ,R.T. 重 现性好。每组中初步检测到 229个代谢物,这些代谢物对应的浓度被用于后续的 多元统计分析。在PCA得分图中，R2X>0.5,表明三组之间可明显区分 (R2X=0.609,Q2=0.213)。在PLS-DA得分图中，这三个比较集中也有明显的区分， 包括 LPS与对照组之间(R2X=0.421,R2Y=0.997,Q2=0.874),LPS+PIO 与 LPS组 之间(R2X=0.233,R2Y=0.959,Q2=0.564),以及 L

6、PS+PIO与对照组之间 (R2X=0.397,R2Y=0.989,Q2=0.938) 。此外,用于差异最大化的OPLS-DA莫型显示三个比较集中的显著区分,包括LPS与对照组之间(R2X=0.421,R2Y=0.997,Q2=0.864),LPS+PIO 与 LPS组之间 (R2X=0.233,R2Y=0.959,Q2=0.627),以及 LPS+PIO与对照组之间(R2X=0.397,R2Y=0.989,Q2=0.936)。由于 PLS-DA OPLS-DA中的关键参数 Q2均>0.5,说明模型稳健、有良好的拟合度和预测性。RPT被用来评估OPLS-DA模型,其中原始的R2,

7、Q2值显著高于对应的置换值,并且所有的Q2均&t;0,说明OPLS-DA莫型稳健、没有过度拟合(分别为R2=0.708,Q2=- 0.492;R2=0.786,Q2= - 0.293;R2=0.6,Q2= - 0.471)。(2) 通过 OPLS-DA!型中 VIP>1 以及 Bonferroni-或 Dunnett-校正的 P值<0.05, 三个比较集中总共鉴定出 52个差异代谢物。他们主要参与氨基酸、能量和核苷酸 (嘌呤、嘧啶 )代谢。在这 52个代谢物中,从三个比较集中分别鉴定出41,15和35个差异代谢物(LPS与对照组之间;LPS+PIO与LPS组

8、之间;LPS+PIO与对照组之间),它们被认为分别与炎症相关抑郁症的发生、PIO的作用，以及上述两个因素之间的相互作用潜在相关。运用IPA分析出三个比较集中的五大最受影响经典通路及改变最显著的互 作网络。此外, 基于这些代谢物的生化联系 , 整合包含最多差异代谢物的通路、 构 建出整体概要图 ,该概要图提示包含多数差异代谢物的神经传递、能量代谢、氧 化应激过程可能参与炎症相关抑郁症的发病机制及PIO的抗抑郁作用。3.小鼠海马内氧化应激相关指标的检测：除神经传递外，GSH代谢通路是 LPS+PIO组与LPS组比较中干扰最显著的通路；此外,IPA互作网络分析预测与抗 氧化过程有关的SODMPOT能

9、与PIO的作用有关。在本研究中,相比于对照组丄PS 组中发现氧化应激的活化,表现为促氧化的NOX亚基gp91phox,p47phox的上调, 抗氧化的SOD1 GPX1的下调。然而,相比于LPS组,这种失衡在LPS+PIO组中被不同程度逆转,与代谢的结 果一致。这些结果提示PIO预处理有效缓解中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁模型中 促氧化/ 抗氧化状态的失衡结论：本研究证实了 PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样、焦虑行为，以及 某些急性病样反应中的有益作用。基于GC-MS勺三组间代谢轮廓分析发现了氨基 酸代谢 , 能量代谢以及核苷酸代谢的扰动 , 提示相关的神经传递、 能量代谢、氧化 应激的扰动可

10、能(至少部分)参与炎症相关抑郁症的发病机制,并且PPAR-y激动 剂可能通过对这些过程的扰动产生抗抑郁作用。此外,WB验证进一步明确了氧化应激的改变。 本研究为炎症相关抑郁症的发 病机制,以及PPARy激动剂在其中发挥抗抑郁作用的分子机制提供新见解 ,同 时可能为伴随免疫活化的抑郁症患者的治疗提供新靶点。第二部分吡格列酮抗抑郁作用的相关信号通路蛋白检测目的：应用PPAR-y激动剂PIO与拮抗剂GW966评价PPARy活化在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁 样行为中的有益作用 , 进行相关信号通路蛋白检测 , 进一步探索其作用机制。方 法:45只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,18-22g)单笼饲

11、养于室温22± 2° C,12h昼 夜节律(早上 8 点开灯), 自由摄食水。在基线时,进行OFT FST,随后经过5天的适应期，期间训练小鼠适应盛清水 的双饮水瓶存在,随后进行SPT需要注意的是,与实验I相比,提前进行OFT与 FST,以避免由于术前、术后检测时间间隔短而造成的潜在影响。在基线行为学评估后 , 将小鼠随机分为 4 组：(1) 对照组(NS,i.c.v.;NS,i.g.;NS,i.p.);(2)LPS组(LPS,i.c.v.;NS,i.g.;NS,i.p.);(3)LPS+PIO组(LPS,i.c.v.;PIO,i.g.;NS,i.p.);(4)LPS+PI

12、O+GW9662 组 (LPS,i.c.v.;PIO,i.g.;GW9662,i.p.)。LPS(血清型 O127:B8),PIO 和 GW966分 别以10 ng/卩L,1mg/mL和2 mg/mL的浓度溶于NS,并且体积分别为1卩L/只,20 mL/kg,1 mL/kg 。在脑立体定位手术前2h和30min分别给予PIO（或NS）和GW9662或NS）处理。 随后，小鼠接受LSP（或 NS）中枢注射。术后的操作流程 , 包括体重测量、行为学检测、样本采集同实验 I（n=9-10） 。 每组中 2 只小鼠接受溴酚蓝染液注射以确保注射位置的准确性。采用WB术进行小鼠海马内相关信号通路及蛋白的检

13、测，包括JAK2/STAT3 通路、CREB/BDN通路及其下游效应分子，以及5-HT1AR（n=6）。结果:1.PPAR-丫 活化对中枢炎性应激诱导的小鼠行为学改变的影响：如实验I,侧脑室LPS注射诱导小鼠出现快感缺失、 行为绝望-抑郁症的核心症状 ;以及焦虑样行为和急性病样 反应,包括体重下降，探索性活动、自主活动的降低（LPS组vs.对照组）。除了体重下降之外,PIO可不同程度地逆转这些表型改变（LPS+PIO组vs丄PS 组）,PIO 的这种改善作用被 GW966阻断（LPS+PIO+GW966组 vs.LPS+PIO 组;LPS+PIO+GW966组vs.对照组）。PIO、GW966

14、2勺预处理对中枢LPS注射诱导 的体重下降无影响。总之，这些结果显示PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样、焦虑样行为及 某些急性病样反应中发挥PPAR-y依赖性的有益作用。2、小鼠海马内相关信号 通路及蛋白检测:（1）为了检测PIO是否通过激活PPAR-y,经特定的信号通路发 挥抗抑郁作用，我们检测了小鼠海马内PPAR-y的水平，以及与炎症诱导抑郁样 行为有关的蛋白激酶，包括JAK2,STAT3的表达。中枢LPS刺激后出现PPAR-y的显著降低（LPS组vs.对照组）,这种降低被PIO预处理逆转（LPS+PIO组vs.LPS组），该PIO效应被GW966阻断 刺激后,促炎细胞因子IL-6表达升

15、高,其下游JAK2/STAT3言号通路活化,表现为 磷酸化 JAK2/总 JAK2（p-JAK2/t-JAK2）,p-STAT3/t-STAT3 的比值上调。有趣的是,PIO预处理抑制了这些改变,而这种抑制效应被GW966阻断。（3） 作为炎症状态下JAK2/STAT3通路重要的下游效应分子,我们发现中枢LPS刺激后 出现的ID01表达增高被PIO预处理显著逆转,该逆转效应被GW966阻断。 接受LPS注射的小鼠脑中5-HT1AR表达显著低于对照组小鼠。PI0预处 理逆转5-HT1AR的下调（LPS+PIO组vs.LPS组），但未能使其恢复至正常水平 （LPS+PIO组VS.对照组）,GW96

16、62阻断PI0的该种效应。作为可被炎症诱导、介导5-HT前体色氨酸沿犬尿氨酸通路降解的限速酶,ID01的活化引起色氨酸分解代谢的增加,可很好地解释抑郁症中5-HT合成的 降低,以及中枢5-HT能神经传递的障碍。此外,5-HT1AR可通过结合5-HT参与中 枢5-HT能神经传递。我们关于ID01、5-HT1AR的发现提供了一种可能性:PPAR-丫的活化可能对中 枢5-HT能神经传递产生潜在影响，这种效应也可能参与PI0在该模型中的有益作 用。（5）本研究中,我们还检测了神经营养相关 CREB/BDN通路,以及下游的突触 可塑性相关蛋白。中枢LPS刺激后,小鼠脑内出现p-CREB/t-CREB比例,以及BDNF表达的显著 下调,这些下调被PI0预处理明显逆转；此外,突触可塑性相关蛋白,包括 SYNI,GAP-43和PSD-95,可介导BDNF勺神经营养效应，也被作为CREB/BDN的下 游效应分子在本研究中被评估。与对照组相比，给予中枢LPS