基因芯片的操作流程及步骤PPT学习教案

1、会计学1基因芯片的操作流程及步骤基因芯片的操作流程及步骤1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES第1页/共88页第2页/共88页第3页/共88页第4页/共88页第5页/共88页细胞细胞对对mRNA进行标记进行标记杂交杂交基因表达资料基因表达资料第6页/共88页基因芯片研制的总体蓝图基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定研制方向的确定基因组序列分析与待检基因组序列分析与待检基因探针序列的确定基因探针序列的确定检测样品检测样品 的制备的制备探针阵列的探针阵列的准备准备检测设备的检测设备的研制研制杂交检测与数据分析杂

2、交检测与数据分析第7页/共88页大量探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于500）于固定支持物上检测每个探针分子的杂交信号强度与被标记的样品分子进行杂交获取样品分子的数量和序列信息第8页/共88页基因芯片是信息时代的产物基因芯片是信息时代的产物横跨横跨：生命科学、物理学、生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学光电技术、材料科学 等现代高等现代高科技。科技。第9页/共88页4.我国主要研究单位我国主要研究单位第10页/共88页第11页/共88页第12页/共88页6400点的基因芯片点的基因芯片 （面积（面积 12X14 mm)第13页/共88页第14页/共

3、88页把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片原型第15页/共88页薄膜型、玻片型微板型集成电路型第16页/共88页第17页/共88页核酸杂交技术核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。是基因芯片应用的基础。第二节、基因芯片技术第二节、基因芯片技术第18页/共88页第19页/共88页 表达型基因芯片的设计表达型基因芯片的设计第20页/共88页一、基因芯片（一、基因芯片（DNA微阵列）微阵列）u 寡

4、核苷酸芯片、寡核苷酸芯片、cDNAcDNA芯片、芯片、GenomicGenomic芯片芯片 u 模式一：是将靶模式一：是将靶DNADNA固定于支持物上，适固定于支持物上，适 合于大量不同靶合于大量不同靶DNADNA的分析，的分析，u 模式二：将大量探针分子固定于支持物上，模式二：将大量探针分子固定于支持物上， 适合对同一靶适合对同一靶DNADNA进行不同探针序列的分进行不同探针序列的分 析。析。 第21页/共88页1.基因芯片原理 基因芯片基因芯片是在基因探针的基础上研制出的。它是在基因探针的基础上研制出的。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品将大量探针分子固定于支持物上，然后与标

5、记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片把大量分子检测单元集成在一个微小的析。基因芯片把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。 基因芯片技术基因芯片技术是建立在是建立在Southern blotSouthern blot基础之上基础之上的，可以说它是的，可以说它是Southern blotSouthern blot的改进和发展，它的的改进和发展，它的原理是：变

6、性原理是：变性DNA DNA 加入探针后在一定温度下退火，同加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。第22页/共88页第23页/共88页第24页/共88页一组寡核苷酸探针一组寡核苷酸探针TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组由杂交位置确定的一组核酸探针序列核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列重组的互补序列靶序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC A

7、TACGTTA第25页/共88页基因芯片荧光标记的样荧光标记的样品品 共聚焦显微镜共聚焦显微镜获取荧光图象获取荧光图象杂交结果分杂交结果分析析探探 针针 设设 计计杂交第26页/共88页提出问题提出问题芯片设计芯片设计芯片制作芯片制作点样方法点样方法 在片合成在片合成试样处理试样处理芯片杂交芯片杂交杂交检测杂交检测数据分析数据分析实际应用实际应用PCR扩增扩增靶基因标记靶基因标记表达差异分表达差异分析析多态性分析多态性分析再测序再测序生物信息学生物信息学数学优化数学优化数据库数据库基因芯片的相关技术示意基因芯片的相关技术示意图图第27页/共88页第28页/共88页基基 因因 芯芯 片片 流流

8、程程样品制备样品制备芯片制备芯片制备杂交杂交杂交信号检测杂交信号检测数据分析数据分析第29页/共88页基因芯片的操作流程第30页/共88页第31页/共88页例例 基于芯片的基因测序基于芯片的基因测序第32页/共88页第33页/共88页cDNA spotted microarrays第34页/共88页点点”，“小点小点”，“低信低信号点号点”进行筛选，并作标进行筛选，并作标记）记）第35页/共88页第36页/共88页第37页/共88页第38页/共88页第39页/共88页第40页/共88页第41页/共88页第42页/共88页第43页/共88页 基因芯片使用步骤基因芯片使用步骤芯片制作芯片制作把探针

9、固定于载体表把探针固定于载体表面面样品处理样品处理目标分子富集目标分子富集分子间的杂交分子间的杂交结果检测与数据分结果检测与数据分析析第44页/共88页原位合成原位合成直接点样直接点样原位光蚀刻合成原位光蚀刻合成原位喷印合成原位喷印合成 分子印章法分子印章法针式点样针式点样喷墨点样喷墨点样光导原位合成法光导原位合成法 第45页/共88页优点是可以用很少的步骤合成及其大量的探针阵列第46页/共88页1、原位光蚀刻合成、原位光蚀刻合成 寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的公司开发的，采用的技术原理是在合成碱

10、基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个光照射使羟基端脱保护，然后一个5端保护的核苷酸端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个个核苷酸的寡聚核苷酸，通过核苷酸的寡聚核苷酸，通过4n个化学步骤能合成出个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过个

11、可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个个化学步骤，化学步骤，8个小时可能合成个小时可能合成65,536个探针。个探针。 第47页/共88页 目前美国目前美国Affymetrix公司已有同时检测公司已有同时检测6,500个已知人类基个已知人类基因的因的DNA芯片，并且正在制备含芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具

12、有诱人的前景。断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。 目前，用于分子诊断的目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。病相关基因的基因诊断。 鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：对对光刻技术进行改进，提高合成效率；光刻技术进行改进，提高合成效率；开发新的原位合成技开发新

13、的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。原位合成。第48页/共88页第49页/共88页第50页/共88页3、原位喷印合成、原位喷印合成 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该需要将特定的碱基喷印在芯片

14、上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。致，因此不特殊制备的化学试剂。 第51页/共88页4、点样法、点样法 点样法是将合成好的探针、点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组或基因组DNA通过特定通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。以是寡核酸。 采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即载玻片上，经一定的化学方法

15、处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。芯片可置于缓冲液中保存。 用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为很小，约为5nl。大规模。大规模CDNA芯片多采用这种方法，与其寡核芯片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类

16、和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产产物。物。 第52页/共88页第53页/共88页第54页/共88页第55页/共88页第56页/共88页第57页/共88页第58页/共88页2.2.基因芯片样品制备基因芯片样品制备 第59页/共88页第60页/共88页2 样本采集过程关键点样本采集过程关键点 氰代磷酸二乙酯氰代磷酸二乙酯(DEPC) 第61页/共88页离体新鲜组织，切成多个离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经

17、，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。）。在在RNase生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。 用铝箔包裹组织，或用用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。液氮冷却。填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期

18、、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐保留保留1-2张取材部位的病理切片。张取材部位的病理切片。第62页/共88页v 以上步骤应在冰上进行且不超过以上步骤应在冰上进行且不超过15分钟，超过时分钟，超过时间会导致样品的间会导致样品的RNA降解。降解。 v 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤对肿瘤组织的取材，要

19、求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。研究的取材部位。 第63页/共88页3.3.基因芯片杂交基因芯片杂交 第64页/共88页第65页/共88页 第66页/共88页第67页/共88页第68页/共88页第69页/共88页4.4.基因芯片检测原理基因芯片检测原理 第70页/共88页杂交信号的检测是杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。芯片技术中的重要组成部分。由于由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号芯片

20、本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像机摄像机等弱光信号探测等弱光信号探测装置。装置。此外，大多数此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不

21、完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像及传输和信号处理及成像三个部分组成。三个部分组成。第71页/共88页1荧光标记杂交信号的检测方法荧光标记杂交信号的检测方法2生物素标记方法中的杂交信号探测生物素标记方法中的杂交信号探测第72页/共88页1荧光标记杂交信号的检测方法荧光标记杂交信号的检测方法（1）激光扫描荧光显微镜）激光扫描荧光显微镜 探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定探测装置比较典

22、型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为510m。同。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台算机控制传动平台XY方向上步进平移，

23、方向上步进平移，DNA芯片被逐点芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成理，最后形成20m象素的图像。这种方法分辨率高、图像象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。研究。 第73页/共88页第74页/共88页（3）采用了）采用了CCD相机的荧光显微镜相机的荧光显微镜 这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微这

24、种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于采用了增管，因而无须扫描传动平台。由于采用了CCD相相机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用 第75页/共88页（4）光纤传感器）光纤传感器 将将 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤芯片直接做在光纤维束的

25、切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。光纤维束由中。光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为根单模光纤组成。每根光纤的直径为200m，两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核，两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（4

26、90urn），激发荧），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由显微镜，由CCD相机接收。相机接收。 这种方法快速、便捷，可实时检测这种方法快速、便捷，可实时检测DNA微阵列杂交情况微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模，因而不便于制备大规模DNA芯片，有一定的应用局限性。芯片，有一定的应用局限性。 第76页/共88页2生物素标记方法中的杂交信号探测生物素标记方法中的杂交信号探测 以生物素（以生物素（biotin）

27、标记样品的方法由来已久，通常都）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙类繁多，因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂芯片杂交将受到很大的限制，

28、因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。采用生物素标记的。 目前应用较多的是美国目前应用较多的是美国General Scanning公司开发的基公司开发的基因芯片专用检测系统因芯片专用检测系统(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦扫，采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了个点的荧光强度数字化后进

29、行分析。近期又开发出了ScanArray 5000，其扫描精度和功能有较大的提高。，其扫描精度和功能有较大的提高。第77页/共88页5.5.结果的分析结果的分析第78页/共88页 第79页/共88页为了使结果的检验更加简便和快速，为了使结果的检验更加简便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了的基因芯片的分析系统中采用了基基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站，对，对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析，仅需要数分钟的时间。这样在短短的分析，仅需要数分钟的时间。这样在短短的几十分钟至数小时内，就可以完成

30、用传统方几十分钟至数小时内，就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。交分析试验。 第80页/共88页第81页/共88页. .结束语结束语 基因芯片作为生物芯片的代表，其发展目标同生物芯片的基因芯片作为生物芯片的代表，其发展目标同生物芯片的目标一样是目标一样是“芯片实验室芯片实验室”(Lab-on-chip)，也即将整个生化检，也即将整个生化检测分析过程缩微到芯片上。测分析过程缩微到芯片上。“芯片实验室芯片实验室”通过微细加工工通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程，而现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程，而且实验过程趋于自动化从而极大地缩短的检测和分析时间，且实验过程趋于自动化从而极大地缩短的检测和分析时间，节省了实验材料，而且又降低人为主观因素，大大提高实验节省了实验材料，而且又降低人为主观因素，大大提高实验的客观性。的客观性。第82页/共88页 基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间，虽然还基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间，虽然还存在这样或那样的问题，但其在基因表达谱分析、基因存在这样或那样的问题，但其在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广