第07章 海洋藻类Crypthecodinium cobnii 异养生长生产二十二碳六烯酸可用的替代碳源佘隽

1、第七章 海洋藻类Crypthecodinium cobnii异养生长生产二十二碳六烯酸可用的替代碳源前言近年来，多不饱和脂肪酸备受关注，这是因为它们在人体中的有着各种生理功能，且有益人类健康。至今，鱼油是主要的脂肪酸；一些海洋微藻种的单细胞油脂（SCO）也含有重要的多不饱和脂肪酸。在本书的各章节中，这些油是主要的脂肪酸来源。重要的异养海洋生物甲藻，Crypthecodinium cobnii，相关研究很多。这仅是多不饱和脂肪酸的一类单细胞油脂DHA，C.cobnii 中积聚了高含量的DHA脂肪酸总量的25-60%。优化DHA生产的重要参数，包括生长率、初始生物量、总脂含量以及脂类中DHA比例。

2、大部分商业化的培养过程中，葡萄糖是主要的碳源和能源。葡萄糖是工业生产中容易获得的原料，从谷物淀粉中通过水解（化学、酶解）得到葡萄糖浆。成本低、获取方便、能浓缩储存，以溶液灭菌，性质稳定。制成水溶液便于发酵，且灭菌容易，传输到最终的发酵罐中是单一的溶液。但它不可能仅满足作为底物的条件。这一章讨论了利用替代碳源-乙酸和乙醇-生长，脂类积聚，DHA生产， C.cobnii批量分批补料式培养培养。通常也将葡萄糖作为可用的原料。乙酸在石化工业中生产的比例很大，其成本是葡萄糖的三倍，大约600美元/t。发酵中大比例使用有缺陷，以浓缩的方式，要求操作小心，任何溢出物或接触到皮肤必须迅速处理。将其归类为“强酸

3、”，它没有盐酸或硝酸这些无机酸攻击性强。因此，大量使用时不需要紧急警告。乙醇能通过发酵生产，在巴西、新西兰、美国广泛生产，被视为“汽油醇”。因为是用葡萄糖发酵生产，其成本高于葡萄糖。“食品级”乙醇，需要满足 “食品级”DHA生产，售价760-800美元/t，现在比乙酸更贵。这些底物，如葡萄糖，是水溶液，因此混在发酵媒介中没有问题。这些底物都是“纯品”，作为人类消费品生产也是适当的。他们没有残留，没有未发酵的化合物，最终的废物可以最小限度处理。分批补料式培养培养中 ，这些底物都可使用，其优点是可以自身消毒，减少污染的风险。使用替代碳源用乙酸或乙醇作为发酵分批补料式培养替代葡萄糖，总体来看在改进生

4、产上减少了成本。如果使用替代分批补料式培养，产量提高，附加产物回收的优点，或改进发酵蒸汽产生的废弃物处理方法，可以额外鼓励转换底物。这样来看，替代分批补料式培养的优点和缺点与原料生产成本没有太大的相关性。在以乙酸和乙醇为底物时，不像葡萄糖，可以马上注意到，这些原料浓度高出1-2%对大部分细胞是有毒的。在发酵过程中使用很少的碳底物是不实际的（最终细胞生物量得率不能超过5g/L）。这个过程中，附加的底物供给到发酵罐，保持底物浓度在限制生长的浓度之下。现在的问题是如何达到附加的浓度，另外，不能超过限制生长的浓度的。可以用下面的行动表明，这不是不能控制的任务。事实上，大部分工业化发酵过程使用分批补料式

5、培养工艺模型来优化生产，这就表示可以在许多引用单元中使用乙酸和乙醇作为底物。使用乙酸 当浓度超过5-10g/L时，乙酸对许多微藻有毒，少量的有机体，能在高于20g/L，甚至在中性条件下时生长。Vazhappily 和Chen就乙酸对于C.cobnii及其他微藻的毒性做了一些初步研究，研究表明C.cobnii能在浓度不超过1g/L的醋酸盐中生长；因为培养基质中有其他碳源，结果不完全清楚。一些初步的实验室研究表明C.cobnii 能在3g/L的乙酸钠中生长，但生长对pH要求严格。这些问题在使用乙酸作为分批补料式培养时都是很关键的。当添加到发酵基质中，乙酸被中和或带进平衡离子，通常是Na+或K+。当

6、细胞生长时，乙酸盐（CH3COO-）消耗，被氢氧离子（OH-）取代，结果导致pH升高。事实上，NaOH是乙酸盐的消耗产物。这件快速增长pH值，制止细胞生长。如果要避免pH值的风险，必须用酸滴定的方法；有没有比乙酸更好的酸？乙酸的容器附在发酵罐上并带有pH计和剂量泵。这些设备能按需要将乙酸加到发酵基质中。在初步研究中，不管C.cobnii在乙酸盐中的不确定生长，乙酸盐能用作碳源和pH连续文化设备，一个适当可行的评估系统，用于生产富集DHA的单细胞油脂。最佳的生产率是初始浓度达到8g乙酸盐/L(图7.1)。细胞的脂类含量只有微小变化（45-50%生物量），初始乙酸盐浓度达到12g/L，油中DHA含

7、量没有实际的变化（40-50%）。图 7.1 （A）生长率，（B）细胞中脂类含量，（C）DHA在脂肪酸总量中含量。C.cobnii在pH6.5，连续文化设备下的乙酸钠中培养。图 7.2 纯乙酸分批补料式培养培养C.cobnii。培养基：10g/L酵母提取物/L,25g海盐/L,8gNaAc/L;10%(V/V)接种物。（A）添加乙酸的生物量干重（DW）;(B)干基中脂类含量，脂类中DHA含量；（C）脂类含量，DHA（rDHA）生产力总容量和DHA浓度。表7.A C.cobnii ATCC30772在葡萄糖和pH连续文化设备下培养，总脂质和中性脂质的脂肪酸分布（%W/W） 总体而言，这个系统的结

8、果优于使用葡萄糖作原料的。生长率提高60%，细胞脂质增加70%，TFA中DHA增长50%（表7.A）。这些增长表明在这些细胞的TAG碎片中，DHA的水平更高。作者解释使用乙酸盐改进C.cobnii，与葡萄糖相比，至少部分是由于它总是在最大可能的速度增长。这一发现被Swaaf 等证实，他们采用长期培养（达400h）细胞生物量回收率为109g/L(图7.2)。然而，这种高密度培养所需的混和物，以维持充足的有氧条件，这种氧气进入系统的传递是由复杂培养粘度增加，这种粘度增加是对胞外多糖生产的结果。工业上生产DHA，培养一个商业化的多糖水解酶制剂，能降低粘度。需要保持一个固定的溶解氧浓度，才能降低搅拌速

9、度。图 7.3 C.cobnii在乙酸和乙醇中可能的DHA生物合成途径。C.cobnii含量低的其他原因可能是培养时分泌了琥珀酸，作者没有注意到在乙酸盐pH连续文化设备控制下，发酵罐中乙酸盐浓度没有与时间一致，实际上，从8g乙酸盐/L到1g/L阶段性递减，不管新加入的乙酸浓度。这种下降表明，有一成的一些细胞外代谢产物乙酸，已证实是聚丁二酸高达5克/ L的，这种积累是由于一个限速步骤存在，作为三羧酸循环的一部分转化琥珀酸酸富马酸（图 7.3）。它加剧了醋酸细胞生长，其中有两条路线现在生产琥珀酸：一个来自异柠檬酸裂合酶以及2-酮戊二酸之一。解决方法是积累琥珀酸（这显然是醋酸的浪费，至少部分的醋酸生

10、物产量低），添加1（v / V）丙酸到介质。图7.4显示了在这些条件下的生物性能的提高。底物生物量增加到约50g/L，总脂达到60的细胞生物量。DHA含量在脂类中依然保持适当的35-40%（表7.B）。与预料的相反，增加丙酸盐剂量在脂类中不适用于奇数链长的脂肪酸（表7.B）。增加的丙酸盐用于用于细胞代谢等其他方面，这可以明显改善碳源。乙醇作为碳源乙醇考虑作为生产单细胞油脂的有潜力的原料，在70年代和80年代在捷克、俄罗斯、日本，在工作中采用。用了一些特别的油脂性的酵母。在这些研究中，Yamauchi等用计算机控制，批量分批补料式培养发酵。这一技术对细胞密度有要求：153g/L超过140h，细胞

11、油脂含量超过50%。C.cobnii生产DHA，作者之前鉴定以培养比例和生产容量作主要因素，在过程中是可行的。明显的， DHA含量高，生物量也高，这在产品回收时也描述了。以实验室的比例培养，C.cobnii ATCC30772 中rDHA报道的葡萄糖是19mgL-1h-1，用葡萄糖 (50%w/v)分批补料式培养生产，生产力相似。以乙酸作为碳源，在pH连续文化设备控制下批量培养，获得48mg DHA h-1L-1产量（图7.2和图7.4）。这一发现表明用C.cobnii生产DHA，碳源影响很大。和乙酸类似，乙醇也是C.cobnii的潜在碳源，经证实其对细胞无毒，能进入细胞并引发代谢。乙醇的利用

12、表明醇脱氢酶的存在，转换乙醇为乙醛，乙醛脱氢酶将转换乙醛为醋酸（图7.3）。作为一个大面积种植碳源，乙醇可能比醋酸有优势，因为它能够产生较高的生物量。特别是乙醇的易燃性质-具体要求储存及大规模应用。此外，乙醇作为发酵原料，需要设备以及另外一个控制系统，在生物反应器中控制适度的酒精浓度。C.cobnii对乙醇的利用在最初的摇瓶培养中进行了研究。藻类生长在一个复杂培养基中，含有酵母提取物，海盐和变化的乙醇浓度。酵母提取物作为单一碳源中是可忽略的。5g/L或10g/L浓度下，细胞生长良好（图7.5）。在这些乙醇浓度下，用生长曲线的指数来计算生长率。与5g乙醇/L培养对比，10g乙醇/L下，显示有一个

13、明显的延长期。乙醇浓度为15g /L或更高时，C.cobnii 生长实际上减弱了。这些数据表明乙醇和乙酸一样，不能直接用于分批培养以达到高的生物量浓度。图 7.4 C.cobnii ATCC 30772在pH连续文化设备下培养，乙酸作分批补料式培养，10g/L图 7.5 初始乙醇浓度对C.cobnii摇瓶培养生长的影响。培养基：2g/L酵母提取物；25g海盐/L;10%（V/V）接种物。乙醇以0、5、10、15、25g/L浓度添加进培养基中。吸光度（OD）值相对1g/L的细胞干重为1。为了避免毒性，供给充足的能量，生长和代谢活力，de Swaaf等在一个2L的计算机控制的实验室生物反应器中改进

14、了乙醇分批补料式培养工艺。脂类生产要求提供充足的氧气，溶解氧浓度（DOT）保持超过30%的空气饱和度。这一目标可以通过控制搅拌速度（范围：200-1250rpm），通过滤法消毒的空气来实现。初始培养基中含乙醇5.5g/ L开始接种。相对于前面介绍的乙酸的过程，乙醇还有一点是不能通过改变pH值来控制。因此，作者根据溶解氧浓度改进了乙醇自动补料系统，这个系统中增加了一个灭菌的乙醇传感器，结果也和以前相似。 C.cobnii在乙醇分批补料式培养下，300g乙醇添加到发酵罐中超过220h的发酵时间（图7.6）。预计在前52h中生长率为0.047h-1,这与乙醇摇瓶培养的生长率很相似（图7.5）。比较葡

15、萄糖生长培养，发现了一个较低的最高生长率。在50h和150h之间，生物量浓度增加缓慢，表明生长被抑制，可能是因为氧气的供给和吸收。生物量浓度水平增加（图7.6）。在这段时间内的脂质生物量从9提高到35%，42在发酵过程结束时达到终值（图7.6）。在这一过程的第一个120小时，脂质DHA含量在44和32之间变化，在最后100小时它保持在33不变（图7.6）。最终细胞干重，脂类，DHA含量分别为83,35，和11.7g/L（图7.6）。后面的值导致DHA生产容量（rDHA）为53mgL-1h-1。生物量以乙醇计算为0.31g生物量/g乙醇，大约比用乙酸计算高2.4倍。图 7.6 用纯乙醇对C.co

16、bnii分批补料式培养。A.乙醇递增时生物量干重（DW）;B.生物量干重中脂类含量，脂类中DHA含量；C.脂类浓度，DHA生产容量（rDHA），DHA浓度。C2碳源生产脂类与葡萄糖相比，乙酸和乙醇作为C.cobnii的碳源导致DHA明显增加(表7.c)。主要原因是乙酸和乙醇直接投料到乙酰辅酶A中提高了生产率(图7.3)。这种能力可以维持高浓度代谢产物，因此在其他的评论中C.cobnii的脂类生物合成是决定性的。在葡萄糖生长细胞中，碳的主通量包括葡萄糖吸收，运输丙酮酸到线粒体，柠檬酸传输到细胞液（ATP）: 柠檬酸裂解酶产生乙酰辅酶A。这在其他微生物的脂类合成中已经研究了。假设一个相似的C.co

17、bnii生物合成DHA的代谢系统（这可能是很大的假设），相比使用乙酸，能生产更高得率的其他细胞或DHA（或两者都有）。出现这种情况是因为乙醇比乙酸的用量少，比乙酸盐能耗少以这种方式减少还原型辅酶（NADH），大量的乙酸盐需要将乙酰辅酶A传输到脂肪酸中。但NADH还未使用，需要含有苹果酸酶、丙酮酸盐的表 7.B C.cobnii在乙酸pH连续文化设备下生长分析，培养基含1%（V/V）丙酸表 7.C 比较C.cobnii在葡萄糖（50%，V/V）,乙酸pH连续文化设备，乙醇补料分批培养循环传输转氢酶(图7.3)。乙醇不仅能生产乙酸盐-乙酰辅酶A（以乙酸盐剂量），更重要的是，它产能比乙酸盐高，单位重

18、量细胞的得率也更高。无论是使用乙醇或乙酸作为为DHA的规模化生产的基材，事实上，要取代葡萄糖，必须等待适当的商业利益的发展。这可能是乙醇的转化脂质的效率大大低于葡萄糖和醋酸，因此可能代表了单细胞油脂生产的最经济的原料。甘油作碳源由于当前从生物柴油中生产粗甘油的丰富而廉价，有可能使用它作为多种发酵投料，包括在单细胞油脂中使用选择性的碳源。Meesters 和 Yokochi 等分别在Cryptococcus curvatus 和Schizochytrium limacinuum中使用纯化甘油生产单细胞油脂。虽然我们没有生物柴油衍生的甘油作为碳源用于C.cobnii生长和DHA生产的数据，也没有获得任何公告覆盖这个主题。我们相信甘油能像葡萄糖一样有效生产生物质和脂类。葡萄糖转化生物质的产率系数通常在0.4-0.5g细胞/葡萄糖，甘油的得率可能与之相同。因为甘油的效率和代谢是葡萄糖的一半。因此，像葡萄糖用于主要的糖酵解途径，在转化