项目二超氧化物歧化酶(SOD)的生产预习方案

1、项目二 超氧化物歧化酶（SOD）的生产 预习方案目录 超氧化物歧化酶（SOD）的概述 超氧化物歧化酶（SOD）作用 超氧化物歧化酶（SOD）生产工艺 SOD酶的检验 酶活性的测定概述 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、简称：SOD。它是一种新型酶制剂，被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。 它生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等，其来源有很多途径，可以根据当地的原料来源、成本需求、技术要求来选取不同的提取途径

2、：植物提取、动物提取、微生物的生产发酵、人工合成等。作用 抗氧化 抗衰老 预防慢性疾病及其并发症 抗疲劳 化疗副作用的消除剂 避免手术的二次伤害（手术会引起大量的自由基，所以手术前后口服抗氧化剂来迅速恢复体力，加速伤口复原）生产工艺 流程图 实验目的 掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作 掌握SOD酶提取分离的一般步骤 了解超氧化物歧化酶的活力的测定方法破碎组织细胞去除杂蛋白SOD的沉淀分离测定邻苯三酚自氧化速率测定SOD样液酶活性实验原理 超氧化物歧化酶（SOD）是广泛存在于生物体内各种组织的一种金属酶，是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶之一 SOD的主要功能是：清除体内多余的自由基，延缓由于自

3、由基侵害而出现的衰老现象，提高人体抵抗自由基诱发疾病的能力 大蒜蒜瓣和悬浮培养液的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出实验原理 有机溶剂的沉淀原理是有机溶剂能够降低水溶液的介电常数，使得蛋白质分子之间的静电引力增大 同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出离心技术 离心:借助离心机旋转所产生的离心力，使不同分子大小、密度的物质分离的技术；要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机

4、、离心方法和离心条件。（台式低速离心机）大蒜SOD的提取分离及纯化方法 磷酸缓冲液提取法：大蒜SOD极性较大，易溶于水，根据“相似相溶”的原理，可用水来浸取大蒜SOD。但磷酸缓冲液可提高浸取效能，增加制品的稳定性，减少杂质，因此实际操作中常采用pH7.8的磷酸缓冲液代替水来浸取SOD，得到粗提取液。但该种方法缺点是浸出范围广，选择性相对较差，容易浸出大量的无效成分。 超声波破碎法：这是一种辅助浸取技术，超声波的“空化作用”产生极大的压力造成被粉碎物细胞壁或整个细胞的破碎，而且整个破碎过程在瞬间完成。 热变性法：热变性法是依据SOD的稳定性原理设计的。SOD的热稳定性高，当温度低于60时，短时将

5、的热处理不会使酶活力有明显的变化，而一般的杂蛋白却在温度高于55时就易变性沉淀，因此，对大蒜粗提液进行短时间的热处理可以达到去除杂蛋白的目的。 有机溶剂分级沉淀法：利用向蛋白质溶液中加入弱极性的有机溶剂，改变溶液的介电常数，使不同种类蛋白质的溶解度产生不同程度降低的原理可进行蛋白质的纯化。在粗酶液中逐量加入丙酮，可使SOD及其它杂蛋白的溶解度发生变化，依次从溶液中沉淀出来。 生物材料的选取的总原则： 材料易得 便于操作 效果显著 实验所需材料：新鲜的大蒜蒜瓣 实验所需仪器：烧杯、试管、容量瓶、研钵、冷冻离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、容量瓶、pH计 实验试剂：0.05mol/L的

6、磷酸缓冲液（pH为7.8）、氯仿-乙醇混合液、冷丙酮、50mmol/L的邻苯三酚、10mmol/L的HCl操作步骤 组织细胞的破碎 称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎；加入pH7.8的磷酸缓冲液15ml，继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲溶液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。 去除杂蛋白： 上清液中加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，静止30min(4C），6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液 SOD酶的沉淀分离： 粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,6000r/min离心15min，得到

7、SOD酶沉淀。 将沉淀溶于pH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液5ml中，然后6000r/min离心15min，弃沉淀，取上清液，用凝胶Sephacry1 S-200进行纯化，然后超滤浓缩。 用紫外分光光度计测定浓缩液的蛋白含量 将浓缩液冷冻干燥后即得成品。SOD酶的检验 原理 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出氧气，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后3045s后就与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成氧气与过氧化氢，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SO

8、D的酶活力。紫外分光光度计 基本结构：光源、单色器、吸收池、检测器、信号指示系统 原理：紫外分光光度计基本工作原理和红外光谱仪相似，利用一定频率的紫外可见光照射被分析的有机物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收。一组吸收随波长而变化的光谱，反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。紫外分光光度计使用方法 打开电源开关 检查吸收池成套性 选择工作波长 选择测量方式 润洗比色皿，依次装入参比溶液和测量溶液 参比溶液于光路中，透射比模式下同时调0和100

9、% 在吸光模式下，测定测量溶液的吸光度酶活性的测定 邻苯三酚自氧化速率的测定 在10ml试管中加入pH值为8.30的50mmol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25+0.5的恒温水浴中保温10min，然后加入在25+0.5的恒温水浴中事先预热好的邻苯三酚溶液（空白管用10mmol/L HCl代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测一次吸光值，连续记录3min，调节邻苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在0.070（+0.002）D/min。经试验测得邻苯三酚溶液的用量为61样品活性的测定 在10ml试管中加入pH为8.30的4.50

10、ml 50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和一定体积的样液，在25+0.5的恒温水浴中保温10min，然后加入在25+0.5的恒温水浴中事先预热好的邻苯三酚溶液61，（空白管用10mmol/L HCl代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测一次吸光值，连续记录3min，调节样液体积，使样液中邻苯三酚的氧化速度控制在0.035（ +0.002）D/min，记录此时样液体积。SOD生产注意事项 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底。 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等 要学会正确使用分光光度计 冷丙酮，一般用于细胞或组织固定，在作

11、冰冻切片免疫组化的 试验中我们经常用到，一般就是在切片前将丙酮放于4度冰箱就可以了，固定时一定要根据你所作材料确定固定时间，因为会引起组织萎缩。 在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现问题的另一个原因 在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不很充分，这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因。 在操作工程中，每一步骤做到准确。参考文献1徐固化，陈芳，生物化学与技术实训 武汉：华中科技大学出版社，2010年1月；2杨荣武，高级生物化学实验 北京：科学出版社，2012；3杨建雄，生物化学与分子生物学实验技术教程 北京：科学出版社，2002年5月4黎瑞珍,杨庆建,陈贻锐.超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定及其应用研究J.琼州大学学报.2004(05)5张宏,谭竹钧.四种邻苯三酚自氧化法测