血液中碳氧血红蛋白饱和度的双波长分光光度简便测定法

1、血液中碳氧血红蛋白饱和度的双波长分光光度简便测定法第18卷,第1期2001年1月光谱实验室Chinese.,rmofSpectroscopyLaboratoryJanuary,2c01血液中碳氧血红蛋白饱和度的双波长分光光度简便测定法刘冬娴胡启芬王彦华谭家镒(中国刑警学院祛医系沈阳市皇姑区塔湾暂83号110035)摘要本文报道血液中碳氧血红蛋白基于吸光度差值的双波长分光光度检测方法:捡血用台有NazS:O的溶液稀释得到HbCO和Hb的双组分溶液,Hb有相同吸光度的双波长处的吸光度差值只反映HbC0拘浓度,HbC0有相同吸光度的双波长处的吸光度差值只反映Hb的液度,测定了这些嗳光度差值可以利用给

2、值与理论值严格一致,当检血是中毒案件捡血时,本方法测定值与可靠方法的测定值严格一致.关键词血,一氧化碳,碳氧血红蛋白,双波长分光光度法.中图分类号;O657.32文献标识码:B文章编号:10048l粥(2001)010035041前言一氧化碳是一种常见引起人中毒死亡的毒物.为确定死因,司法鉴定中常需要进行血液碳氧红蛋白饱和度(HbCO)的测定.在各种类型的测定方法中,以光谱法应用最为广泛,因为该类方法总体上看都具有操作简便,快速,结果准确可靠的特点.常用的光谱法中有等吸光点法,联立方程组法0,双波长法0,导数光谱法r等.其中导数光谱法需要使用能进行导数光谱测定的仪器,普遍性应用受到限制;等吸光

3、点法和联立方程组法易受血液澄清度的影响,测定值准确性差;艘波长法需要对检血及通一氧化碳饱和后检血2次测定,操作不够简便本文报道的双波长法使用普通光谱仪,不受血液澄清度影响,不需对检血通一氧化碳前后2次测定,因此是一种简便,准确,可广泛应用的方法2实验部分岛津UV250型紫外可见分光光度计,狭缝宽度2nm,吸光池厚lcm.新煮沸放冷的蒸馏水中.作者简舟;刘冬娴(1963一),女.湖南省长沙市人,学士|湖南高等公安专科学校讲师,中目刑蓄学院进修生;王彦华(19B6一),男,内蒙古赤峰市.博士,中国刑蓄学院讲师谭家镒(1942一),男.辽宁省昌图县人,硕士,中国刑蓄学院救授,以上4均从事挂医毒物分析

4、的教学和研究工作10-11光谱实验室已知HbCO的检血:取不吸烟人的血液,用稀释剂进行约200倍的稀释,把血稀释分成2份,其中一份通一氧化碳至饱和,再用氮气赶除溶解的一氧化碳,与另一份稀释血液按一定的比伊混台,得到一系列巳知HbCO的检血(测定时不再稀释).2份,一份通一氧化碳至饱和为碳氧血红蛋白HbCO溶液,另一份为浓度相等的还原血红蛋白Hb溶液.测定各份Hb溶液在530nm处的吸光度和583nm至584nm每间隔0.1nm处的吸光度,找出527nm至528nm每间隔0.1nm处的吸光度,找出吸光度与554.5nm()处吸光度相等的波长().由不同人血,不同稀释度测得的z和计算和的平均值见表

5、1.在和(上述求出的平均值)处分目U测定上述各HbCO溶液的吸光度和,在和丑(上述求出的平均值)处分别测定上述各Hh溶液的,和.用相同浓度的HbCO溶液和Hb溶液(也即同一人,同一稀释浓度的通一氧化碳饱和血和不通一氧化碳血)捌得的,z,H和A按公式K=(一A.)/(A一)计算K值.由不同血源,不同稀释度血液计算的K值求出平均K值(表,口取检血1滴,用稀释剂进行约200倍的稀释,测定,(,为上述求出的平均值)处的吸光度值,z,A和A,按本文公式(6)计算HbCO.3结果与讨论在测定波长范围内血液中的吸光物质为各种形式的血红蛋白,即氧和血红蛋白HbO,碳氧血红蛋白HbCO和还原血红蛋白Hb,不吸烟

6、人血中可认为无HbCO,稀释剂中的连二亚硫酸钠可将血中的Hb还原为Fib,对HbCO无作用.因此可认为稀释剂稀释的不吸烟人血是Hb溶液,稀释剂稀释的一氧化碳中毒人血是Hb和HbCO的混合溶液,稀释剂稀释的血通一氧化碳饱和后是IHbCO溶液图1为HbCO溶液与Hb溶液的光谱图(图中HbCO溶液与Hb溶液的浓度相等),从图1可见530nm()与583nm附近某波长(2)是Hh的等吸收波长对,554.5nm()与527nm附近某波长()是HbCO的等吸收波长对,且在Hb的等吸收波长对处HbCO有较大的吸光度差值(图中D),在HbCO的等吸收波长对处Hb有较大的吸光度差值(图中D).图2是一份用稀释剂

7、稀释的一氧化碳中毒检血的光谱图.对于稀释的检血测得的光谱图,从上述等吸收波长的意义可得:1一A2一(e1Hb.一Ez)×CHbc0(1)d3一d=(HbE'Hb)×CHb(2)式中,.,山和A的意义如图2所示,e"为.波长处HbCO的摩尔吸光系数,为一常数,稀释检血中HbCO和Hb的摩尔浓度.根据HbCO的定义,对于稀释中毒血液:HbCO=Cm/(C.bc0+CHb)t3)设K一(elbc.一E2")/(白Hb一Hb)(4)由于E2.等均为常数,式中K应为常数,可由实验测得,即本文测得的K值.由(1),(2),(3),第1崩刘誊相等:血渡中碳氧血

8、红蛋白饱和度的双坎长分光光度简便测定挂釜渡长Mnm图1HhCO和Hb的吸收光谱图HbCO;一Hb.波长,nm图2一份稀释(同时也被还原)检血的吸收光谱图(4)式可得:HbCO=(一A)/E(A一A)十K(A一A.)将测得的值(见3.2)代人公式(5):HbCO一(A1一A2)/E(A一A2)十1.297(A一A)因此,只要测定稀释检血的A,Az,A和A即可计算其HbCO.取了多名不吸烟自愿者血液制成HbCO及Hb溶液按前述实验方法测定,结果如表1所示.从表1数据可见等吸收波长z,及值都非常恒定,表明本文方法原理是正确的,检血测定值准确性有保障.按本文实验方法配制已知HbCO的检血数份,取实际中

9、毒案件的尸体血液数份,分别用本文方法,文献3报道的双波长法,文献E43报道的导数光谱法进行测定,每份检血每种方法各测定2次取平均(5)【6)血积稀释倍数等吸收被长值,其中第3和第4份检血用本文方法测定6次计算平均值及标准差(sD),结果如表2所示.方法的铡定值与文献报道的准确性好的方法(但操作不够简便或仪器不够普遍)测定值一致各种光谱法测定rabco0A都适台于新鲜血,不适合于腐败血.存放时间较长,没有腐败的陈旧38光谱实验室第18卷浊对入射光有散射作用,表现出的吸收光谱为一条几乎与基线平行的直线(吸光度在各波长处基本相等),根据光谱的加台性以及本文方法的原理可以判断混浊对本法测值准确性不产生

10、影响(图2中的A和a值不困混浊呈现的吸收而变化).相似的也可以推断文献3,4报道的双波长及导数光谱法测定的准确性也不受轻微混浊的影响.但根据测定原理,等吸光点法和联立方程组法测定的准确性会明显受到混浊的影响,这两种光谱法因此不适台陈旧血的测定.表2方法准确性考查参考文献13SickTJ?DeterminationofCarboxyhemoglobLninthePresenceofOtherBloodHemoglobinPigmentsbyVisibleSpectrophotometJ.Jr版摊,i984.29:3954.23RodkeyF【etalSpectrophotometticMeasu

11、mmemofCarboxyhemoslobinandMethemoglobininBlood_o3.ClinicalC&emisOO-.1979,25:l3881393.ComparisonwithGasChromatographicMethod口.ForemScmelmernatrad.1983,21ll87195.43谭家镒,杨鸣.四阶导数光谱法测定血棱碛氧血红蛋白饱和度J_中璃法噩学枭志,1988.3;206-209.ASimplemethodofCarboxyhemoglobinDeterminationbyDoubleWavelengthSpectrophotomet

12、ryofAbsorbanceDifferenceLiuDong-XianHuQi-FenWANGYan-HuaTANJia-Yi(DepartmentoLegalMedm'neCrbninalPdiceCotlege.fCfunaShenjocrng110035tP.R.Chma,AbstractThispaperdescribedthespectrophotometricdeterminationofcarboxyhemoglobininbloodonthethetwowavelengthsatwhichHbhassameabsorbancereflectsonlytheHbCOcomponentandabsothancedifferenceattheothertwowavelengthsatwhichHbC0hassi'neabsorbancereflectsonlytheHbcomponent.Aftermeasurementofthisabsorhancedifferences,