蛋白质分离、纯化

1、会计学1蛋白质分离、纯化蛋白质分离、纯化一、盐析一、盐析盐析盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。 常用常用硫酸铵硫酸铵进行沉淀。进行沉淀。分级沉淀分级沉淀：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋 白质分阶段沉淀下来。白质分阶段沉淀下来。优点优点：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等。：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等。不足不足：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程 产生不良影响。产生不良影响。v二、有机溶剂分级沉淀二、有机溶剂分级沉淀有机溶剂如有

2、机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等（保持低等（保持低温），能温），能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。的溶解度降低而沉淀。优点优点：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。缺点缺点：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格低温。低温。三、超速离心法三、超速离心法在强大的离心力的作用下，溶液中在强大的离心力的作用下，溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而使溶液和沉淀物质分开。，从而使溶液和沉淀物质分开。Protein的等电点（的等电点（P

3、I） 1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的荷为零时的溶液的pH值称为值称为PI(isoelectric point). 2、当、当pH值值 PI 时，蛋白质带负电荷时，蛋白质带负电荷 当当pH值值PI 时，蛋白质带正电荷时，蛋白质带正电荷 当当pH值值=PI 时，蛋白质带净电荷为零时，蛋白质带净电荷为零电泳分离电泳分离正极移动正极移动负极移动负极移动不移动不移动五五 透透 析析按照分子大按照分子大小进行分离小进行分离.分离取决于分离取决于透析袋截留透析袋截留的分子量。的分子量。透析液透析液浓缩的蛋白浓缩的蛋白混合

4、样品混合样品 透析袋透析袋 开始透析开始透析处于平衡状态处于平衡状态五、透五、透 析析加加压压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图溶胀：溶胀：称取适量凝胶干粉，用约称取适量凝胶干粉，用约1010倍蒸馏水浸泡倍蒸馏水浸泡2424小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。悬浮物及蒸馏水。碱洗：碱洗：用用0.5 M NaOH 0.5 M

5、NaOH 溶液浸泡半个小时，然后溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。用蒸馏水洗至中性。酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。蒸馏水洗至中性。平衡：平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pHpH与与起始缓冲液相同。起始缓冲液相同。1. 1. 将层析柱垂直固定，加入适将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。量溶剂排走空气。2. 2. 将平衡好的凝胶搅匀，连续将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至倾入柱中，待其自然沉降至1/41/31/41/3高时打开下端出口，高时打开下端

6、出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。柱时要注意操作压。3. 3. 用用3-53-5倍柱床体积的起始缓冲倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。，柱床稳定。 装装 柱柱1. 1. 如图装好层析装置，打开下端出如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面面2. 2. 沿柱壁缓慢加入沿柱壁缓慢加入2ml2ml样品，打开下样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液到凝胶胶面，

7、再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。洗涤柱壁。3. 3. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。4. 4. 用自动部分收集器自动或手动收用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（也存在等电点（pIpI），蛋白质在溶液中带电状况同），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的氨基酸相同，取决于所处溶液的pH pH 值。值。当当pI pHpI pHpI pH时，蛋白质带净正电荷。时，蛋白质带净正电荷。注意注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换

8、剂本身带正电荷。：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质低离子低离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品混合蛋白样品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度/(%)/(%) 10104 4 20-30 20-30 1-4 1-410104 4 15-20 15-20 1-5 1-510104

9、4-1-110105 5 10-15 10-15 1 110105 5 5-10 5-10 5 510105 5 2-5 2-5分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围与凝胶浓度的关系凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备 蛋白质样品准备蛋白质样品准备 点样点样 电泳电泳 染色与脱色染色与脱色 样品回收样品回收 在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。豌豆肌动蛋白异型体豌豆肌动蛋白异型体I I圆二色谱圆二色谱 蛋白质免疫印迹装置蛋白质免疫印迹装置上面为三明治结构侧面观，下面为三明治结构顶面观上面为三明治结构侧