色谱法导论课件

1、第十八章 色谱法导论Chapter 18 Introduction of Chromatography 教材教材468页页18-1 概论概论18-2 色谱法基础知识、基本概念及术语色谱法基础知识、基本概念及术语18-3 色谱动力学基础理论色谱动力学基础理论18-4 组分分离组分分离-基本分离方程基本分离方程18-5 色谱方法选择和分离操作条件优化色谱方法选择和分离操作条件优化18-6 色谱定性分析色谱定性分析18-7 色谱定量分析色谱定量分析18-1 概论（概论（Introduction） Separation Science 分离科学分离科学 分离（分离（separation）混合物组分迁移

2、并在空混合物组分迁移并在空间上重新分布以实现间上重新分布以实现分离目标分离目标.分离科学：基于色谱技术和色谱理论分离科学：基于色谱技术和色谱理论色谱是一种重要的物理化学分离方法。色谱是一种重要的物理化学分离方法。M. S. Tswett （茨维特）（茨维特）1903年年-1906年年色谱概念的提出色谱概念的提出1941年（年（Martin & Synge）液液分配色谱法液液分配色谱法1952年（年（James & Martin）气液分配色谱法气液分配色谱法1957年（年（Golay）气相色谱法气相色谱法1944年（年（ Consden ）纸色谱纸色谱1949年（年（ Mecll

3、ean ）薄层色谱法薄层色谱法1960s高效液相色谱法高效液相色谱法1980s毛细管电泳法毛细管电泳法 1948年年 瑞典瑞典 Tiselius 电泳技术与吸附作用电泳技术与吸附作用 1952年年 英国英国 Martin & Synge 分配色谱法分配色谱法根据混合物各组分在互不相溶的两相（固定相和流动相）中根据混合物各组分在互不相溶的两相（固定相和流动相）中吸附能力、分配系数或其他亲和作用性能的差异作为分离依吸附能力、分配系数或其他亲和作用性能的差异作为分离依据。据。Chromatography 【IUPAC】Chromatography is a physical method o

4、f separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction. 按照按照相的类型相的类型分类分类 气气；气液；气固；液液；液固气气；气液；气固；液液；液固 按照按照分离机制分离机制分类分类 物理、机械；物理、机械； 物理化学；物理化学； 化学化学 按照按照分离过

5、程推动力分离过程推动力分类分类 平衡过程和平衡过程和 速率控制过程速率控制过程 流动相是气体，称为气相色谱流动相是气体，称为气相色谱 用液体做流动相的，称为液相色谱用液体做流动相的，称为液相色谱 用超临界流体作流动相，称为超临界流体色谱用超临界流体作流动相，称为超临界流体色谱 柱色谱法柱色谱法纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法 吸附色谱法吸附色谱法 吸附剂表面对不同组分的吸附性能差异吸附剂表面对不同组分的吸附性能差异 分配色谱法分配色谱法 不同组分在两相中分配系数的差异进行分离不同组分在两相中分配系数的差异进行分离 离子交换色谱法离子交换色谱法 离子交换原理离子交换原理 排阻色谱法排阻色谱法

6、 利用多孔性物质对体积不同分子的排阻作用利用多孔性物质对体积不同分子的排阻作用 迎头色谱法迎头色谱法 以试样混合物作流动相的色谱方法以试样混合物作流动相的色谱方法 洗脱色谱法（淋洗色谱法）洗脱色谱法（淋洗色谱法） 以吸附能力或其他作用能力比试样组分弱的气体或液体以吸附能力或其他作用能力比试样组分弱的气体或液体作流动相的色谱法作流动相的色谱法 顶替色谱法（置换色谱法）顶替色谱法（置换色谱法） 以含吸附能力或其他作用能力较被分析组分强的组分做以含吸附能力或其他作用能力较被分析组分强的组分做流动相的色谱法流动相的色谱法18-2 色谱法基础知识、基本概念和术语色谱法基础知识、基本概念和术语SP：固定相

7、；：固定相；MP：流动相：流动相色谱分离是基于试样中各组分在两相间平衡分配的差异色谱分离是基于试样中各组分在两相间平衡分配的差异msCCK 分配系数分配系数：在一定的温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组：在一定的温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的分在固定相中的浓度浓度CsCs与在流动相中的与在流动相中的浓度浓度CmCm之比。之比。 K值大的组分在固定相中滞留时间长，值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；反之，后流出色谱柱；反之，K值小的组分先值小的组分先流出色谱柱。流出色谱柱。 混合物中各组分的分配系数相差越大，混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分

8、离。越容易分离。 【习题习题】组分组分A、B在某气液色谱柱上的分配在某气液色谱柱上的分配系数分别为系数分别为495和和467，试问在分离时哪个组，试问在分离时哪个组分先流出色谱柱？分先流出色谱柱？分配系数分配系数：表征组分与固定相分子间作用力的大小。：表征组分与固定相分子间作用力的大小。K K值越大，组分与固定相的亲和力大；组分在色谱柱值越大，组分与固定相的亲和力大；组分在色谱柱中滞留的时间越长，移动速度慢中滞留的时间越长，移动速度慢例题msnnk 保留因子保留因子： 在一定的温度和压力下，在一定的温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的固定

9、相中的质量质量n ns s与在流动相中的与在流动相中的质量质量n nm m之比。之比。分配系数与保留因子kVVnnKsmmsVnVnmmssmsccV Vs s：色谱柱中固定相的体积色谱柱中固定相的体积；V Vm m：色谱柱中流动相的体积色谱柱中流动相的体积 ：称为相比；称为相比；分布等温线：分布等温线：在恒定温度下，将在恒定温度下，将cs对对cm作图所得溶质在两相中的作图所得溶质在两相中的浓度关系曲线。浓度关系曲线。根据等温线形状分为：根据等温线形状分为：线性等温线；凸性等温线和凹形等温线线性等温线；凸性等温线和凹形等温线 Freundlich 方程方程溶溶质质的的气气体体平平衡衡分分压压固

10、固体体吸吸附附剂剂的的量量吸吸附附溶溶质质的的量量常常数数pmXnKpmXn1nmsKcc1mscnKclg1lglg1/n-1/n-决定等温线形状决定等温线形状1 1： 线性等温线线性等温线1: 1: 1: 凹形等温线凹形等温线 Langmuir （朗缪尔）方程（朗缪尔）方程 单分子吸附层理论单分子吸附层理论和和吸吸附附量量形形成成单单分分子子吸吸附附层层的的饱饱分分布布系系数数211211KKpKpKKcmXsBET（Bnunaure-Emmett-Teller）方程）方程多分子层吸附理论多分子层吸附理论022011CpKpCCKppcps 体积流量（体积流量（Fc） 单位时间内流经色谱柱

11、的平均体积单位时间内流经色谱柱的平均体积 线速度（线速度（u） 单位时间内流动相流经色谱柱的长度单位时间内流动相流经色谱柱的长度 MtLu 记录信号强度随时间变化的曲线记录信号强度随时间变化的曲线流出曲线或色谱图流出曲线或色谱图峰高峰高：从色谱峰顶点到基线的距离：从色谱峰顶点到基线的距离标准偏差标准偏差 ：转折点间距离的一半：转折点间距离的一半峰底宽度峰底宽度 WW： 色谱峰转折点处切线与基线相交的截距色谱峰转折点处切线与基线相交的截距半峰宽半峰宽：峰高一半处的峰宽度峰高一半处的峰宽度峰面积峰面积4W354. 2221X 比移值比移值 溶质通过色谱柱的平均线速度与流动相平均线速度溶质通过色谱柱

12、的平均线速度与流动相平均线速度之比之比数数溶溶质质在在固固定定相相中中的的分分子子数数溶溶质质在在流流动动相相中中的的分分子子ssmmxfnnnnnuuRm10fR 保留值保留值 试样中各组分在色谱柱中试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值，如保留滞留时间的数值，如保留时间或保留体积时间或保留体积保留时间保留时间(tR) 从进样开始到色谱峰最大从进样开始到色谱峰最大值出现所需的时间，称为值出现所需的时间，称为保留时间保留时间xRuLt 死时间死时间(tM) 不被固定相保留的组不被固定相保留的组分，从进样到出现峰分，从进样到出现峰极大值所需的时间极大值所需的时间调整保留时间调整保留时间(tR) 组

13、分的保留时间与死组分的保留时间与死时间之差值。时间之差值。uLttttMMRR；保留体积保留体积 VR 从进样开始到色谱峰最大值出现时所通过的流动相的体积从进样开始到色谱峰最大值出现时所通过的流动相的体积 死体积死体积 VM 不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相体积不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相体积RcRtFVMcMtFV调整保留体积调整保留体积 保留体积减去死体积保留体积减去死体积MRRVVV 溶质分布在固定相和流动相的分子数或物质的量之溶质分布在固定相和流动相的分子数或物质的量之比。比。msVVKqpkssmmmRcVcVcV流出色谱流出色谱柱的组分柱的组分流动相中流动相中残留组

14、分残留组分固定相中固定相中残留组分残留组分V VR R：保留体积；：保留体积；c cm m： 组分在流动相中的平衡浓度；组分在流动相中的平衡浓度；c cs s： 组分在固定相中的平衡浓度；组分在固定相中的平衡浓度；V Vm m：柱内流动相的体积；：柱内流动相的体积；V Vs s：固定相的体积：固定相的体积SRKVVsMRKVVVssmmmRcVcVcVsmsmRVccVVMmVV msmsVVKnnksMRKVVVMRMMRMSSMRVVVVVVVVVVkMRttk 保留因子保留因子k k：反映色谱柱对组分保留能力的参数：反映色谱柱对组分保留能力的参数; k; k越越大，保留时间越长大，保留时

15、间越长 。 保留因子可以通过色谱图求出。保留因子可以通过色谱图求出。 相对保留值（选择性因子）相对保留值（选择性因子）相对保留值相对保留值组分在色谱体系中的平衡分配差异；组分在色谱体系中的平衡分配差异；其值越大，越容易分离。其值越大，越容易分离。注意：相对保留值是注意：相对保留值是调整保调整保留值留值之比之比 保留指数又称柯瓦（保留指数又称柯瓦（Kovasts）指数，是一种重现性）指数，是一种重现性较其他保留数据都好的定性参数，可根据所用固定相较其他保留数据都好的定性参数，可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。 （可用（可用内插法求得保

16、留指数）内插法求得保留指数）lglglglgn100)()1()()(nRnRnRXRRttttI同系物保留值对数与碳原子数成线性关系 色谱柱的总空隙度色谱柱的总空隙度 柱横截面上流动相所占的分数（流动相体积柱横截面上流动相所占的分数（流动相体积/柱总柱总体积）体积） udFVVVVVcccMcpiT24 渗透率（渗透率（Kf）与阻抗因子（）与阻抗因子（）pdFcLKKcTf2402202LtpdKdMpp用一根固定相的体积为用一根固定相的体积为0.148 mL，流动相的体积为，流动相的体积为1.26 mL的色谱柱分离的色谱柱分离A, B两个组分，它们的保留时间分别为两个组分，它们的保留时间分

17、别为14.4 min和和15.4 min，不被保留组分的保留时间为，不被保留组分的保留时间为4.2 min，试计，试计算：算：（1）各组分的保留因子）各组分的保留因子k（2）各组分的分配系数）各组分的分配系数 K（3）AB两组分的选择因子两组分的选择因子B,A信息分析信息分析公式选择公式选择 kA= (14.4 min-4.2 min)/4.2 min=2.43 kB= (15.4 min-4.2 min)/4.2 min=2.67MMRMRtttttk用一根固定相的体积为用一根固定相的体积为0.148 mL，流动相的体积为，流动相的体积为1.26 mL的色谱柱分离的色谱柱分离A, B两个组分

18、，它们的保留时间分别为两个组分，它们的保留时间分别为14.4 min和和15.4 min，不被保留组分的保留时间为，不被保留组分的保留时间为4.2 min.(1)各组分的保留因子各组分的保留因子k用一根固定相的体积为用一根固定相的体积为0.148 mL，流动相的体积为，流动相的体积为1.26 mL的色谱柱分离的色谱柱分离A, B两个组分，它们的保留时间分别为两个组分，它们的保留时间分别为14.4 min和和15.4 min，不被保留组分的保留时间为，不被保留组分的保留时间为4.2 min.(2) 各组分的分配系数各组分的分配系数 KsmVVkkK7 .20148. 026. 143. 2mLm

19、LVVkKSMAA同理可求同理可求B的分配系数的分配系数KB = 22.7 用一根固定相的体积为用一根固定相的体积为0.148 mL，流动相的体积为，流动相的体积为1.26 mL的色谱柱分离的色谱柱分离A, B两个组分，它们的保留时间分别为两个组分，它们的保留时间分别为14.4 min和和15.4 min，不被保留组分的保留时间为，不被保留组分的保留时间为4.2 min.（3）AB两组分的选择因子两组分的选择因子B,A10. 17 .207 .22,ABABKK10. 143. 267. 2,ABABkk18-3 色谱动力学基本理论色谱动力学基本理论 线性理想色谱线性理想色谱 线性非理想色谱线

20、性非理想色谱 非线性理想色谱非线性理想色谱 非线性非理想色谱非线性非理想色谱分布等温线理想色谱过程：溶质在两相间物质交换在热力学上可逆，传质速率很高，平衡瞬间实现，分子扩散可以忽略。塔板理论塔板理论: : 将连续的色谱柱设想成若干小段，将连续的色谱柱设想成若干小段，每一段均由固定相和流动相填充，每一段均由固定相和流动相填充，组分在其内迅速达到分配平衡。组分在其内迅速达到分配平衡。每段称作一个每段称作一个理论塔板理论塔板；其长度；其长度称称理论塔板高度理论塔板高度。 色谱柱内径一致、填充均匀；色谱柱内径一致、填充均匀； 溶质在每个塔板的分配系数不变；瞬间可达平溶质在每个塔板的分配系数不变；瞬间可

21、达平衡；纵向分子扩散可忽略；衡；纵向分子扩散可忽略； 流动相脉冲式流经色谱柱流动相脉冲式流经色谱柱RVVVVMeNcRRN22212RVMNc212max 理论塔板高度（理论塔板高度（H）NLH 理论塔板数（理论塔板数（N）2221254. 516VtWtNRR 有效理论塔板数（有效理论塔板数（Neff）2221254. 516ttWtNRReff21kkNNeffRRRMRtttttk塔板理论部分反映了色谱过程分子迁移规律，对柱塔板理论部分反映了色谱过程分子迁移规律，对柱效评价具有重要实用价值。效评价具有重要实用价值。 基本假设过程忽略色谱过程的动态特征，忽略了扩基本假设过程忽略色谱过程的动

22、态特征，忽略了扩散、传质等过程。散、传质等过程。用一根柱长为用一根柱长为1 m的色谱柱分离含有的色谱柱分离含有A，B，C，D四四个组分的混合物，它们的保留时间个组分的混合物，它们的保留时间tR分别为分别为6.4 min,14.4 min,15.4 min, 20.7 min,其峰底宽其峰底宽W分别分别为为0.45 min, 1.07 min, 1.16 min, 1.45 min。试计算各谱峰的理论塔板数。试计算各谱峰的理论塔板数。3261)min45. 1min7 .20(162820)min16. 1min4 .15(162898)min07. 1min4 .14(163236)min45

23、. 0min4 . 6(16)(1622222DCBARNNNNWtN 涡流扩散项涡流扩散项 A 分子扩散项分子扩散项 传质阻力项传质阻力项CuuBAH速率方程（范第姆特方程）：速率方程（范第姆特方程）：uBCu 涡流扩散项涡流扩散项A (多径项多径项)pdA2 ：填充不规则因子；：填充不规则因子；d dp p：填充颗粒的平均直径：填充颗粒的平均直径 涡流扩散项与流速无关；涡流扩散项与流速无关； 固定相颗粒小且粒度均匀可降低固定相颗粒小且粒度均匀可降低 ，提高柱效，提高柱效 分子扩散项分子扩散项uBmDB2： 阻碍因子；Dm：组分分子在气相扩散系数。减小分子扩散项的策略减小分子扩散项的策略：

24、使用相对分子量大的载气使用相对分子量大的载气（MwMw； D Dm m ） 采用较高的载气线速度采用较高的载气线速度1. 1. 控制较低的柱温控制较低的柱温 （T ; DT ; Dm m ）传质阻力项传质阻力项uCCCms)(umpDdkkC222m)1 (01. 0uDdkkqCsfs22)1 (k: 容量因子dp：填充颗粒的平均直径；Dm：组分在流动相中的扩散系数；q: 结构因子df：固定相液膜厚度；Ds：组分在固定相中的扩散系数；uDdkkuDdkkuDdHsfmpmp22222218101. 022uDdkkuDdkkquDduDdHmpiisfmpmp22222211301122提高

25、柱效方法：提高柱效方法： 减小填料颗粒粒度；减小填料颗粒粒度； 用黏度低的溶剂作流动相；用黏度低的溶剂作流动相； 采用低流速流动相；采用低流速流动相； 减少填料空穴深度；减少填料空穴深度；1. 1. 适当提高柱温适当提高柱温 流动相的流速流动相的流速 填料粒径填料粒径（dp） 色谱柱温色谱柱温 uDdkkuDdkkuDdHsfmpmp22222218101. 022CuuBAHSMoptCCBuSMCCBAH2minuDdkkuDdkkuDdHsfmpmp22222218101. 022 扩散系数扩散系数Ds 扩散系数扩散系数DmuDdkkuDdkkuDdHsfmpmp22222218101.

26、 022CuuBAuh31Knox方程Knox方程主要用于色谱参数的优化过程222222ordecftuinEX18-4 基本分离方程基本分离方程分离度分离度R定义为相邻两峰保留值之差与两峰宽定义为相邻两峰保留值之差与两峰宽之和的一半的比值之和的一半的比值)()(21)()(ABARBRWWttR分离度分离度：衡量色谱柱：衡量色谱柱分离效能的总指标！分离效能的总指标！)1)(1(4BBkkNR222)1()1(16NBkkRB22)1(16RNeff21kkNNeffuHkkRtR22322221116 峰容量：峰容量：一定条件下色谱柱在一定时间能容纳到一定分离度一定条件下色谱柱在一定时间能容

27、纳到一定分离度（R1）色谱峰的数量）色谱峰的数量.色谱柱峰容量越大，分离能力越强。色谱柱峰容量越大，分离能力越强。 在在3.0 m色谱柱上，分离色谱柱上，分离A、B组分，其保留时间组分，其保留时间分别为分别为14.0 min和和17.0 min，不被保留的组分的保，不被保留的组分的保留时间为留时间为1.0 min，B 组分的峰底宽度组分的峰底宽度W为为1.0 min。 计算计算A和和B达到基线分离时（达到基线分离时（R=1.5）的柱长为多）的柱长为多少？少？23. 1min0 . 1min0 .14min0 . 1min0 .17,RABRABtt4096)1min1min17min16)(1

28、622（WtNRBBeff1029)123. 123. 1(5 . 116)1(16222,2ABABBRNeffmL340961029柱效正比于柱长柱效正比于柱长L=0.75m18-5 色谱方法选择和分离条件优化色谱方法选择和分离条件优化气相色谱气相色谱-各种气体、挥发性组分各种气体、挥发性组分液相色谱液相色谱-非挥发性组分非挥发性组分 提高理论塔板数提高理论塔板数 调节、控制保留因子调节、控制保留因子 提高选择性因子提高选择性因子 终极目标：实现短时间内的高效分离 适当增加柱长适当增加柱长 注意：随着柱长的增加，分离时间延长。注意：随着柱长的增加，分离时间延长。 气相色谱和液相色谱各不相同

29、。气相色谱和液相色谱各不相同。 提高柱效（提高柱效（N） 流速、填料粒度及柱温流速、填料粒度及柱温222221116KKHRLuHkkRtR22322221116k值范围 210调节方法：改变柱温更换色谱柱衍生化反应 改变流动相组成改变流动相组成 改变柱温改变柱温 改变固定相改变固定相)1)(1(4BBkkNR18-6 色谱定性分析色谱定性分析定定性性分分析析 在一定色谱条件下，各种物质的保留值一定。在一定色谱条件下，各种物质的保留值一定。 在在相同色谱条件相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，者保留值相同，可能可能为同一物质。为同一物质。 此方

30、法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。作条件，尤其是流速。 未知试样的色谱图未知试样的色谱图1； 在未知试样中加入某已知物，得到色谱图在未知试样中加入某已知物，得到色谱图2； 对比分析，峰高增加的组分即可能为加入的组分对比分析，峰高增加的组分即可能为加入的组分保留指数法保留指数法lglglglgn100)()1()()(nRnRnRXRRttttI 使用选择性的检测器使用选择性的检测器 GC-MS LC-MS GC-FTIR 18-7 色谱定量分析色谱定量分析 组分的量与色谱检测器的响应值成正比。组分的量与色谱检测器的响应值成正

31、比。212 XhA定定量量分分析析外标法外标法 外标法，也称为校准曲线法。外标法，也称为校准曲线法。 绘制标准曲线；绘制标准曲线； 测试样品测试样品 查找被测组分的含量查找被测组分的含量 A(h)CA A待待C C待待 将一定量的纯物质作为内标物加入到准确将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中，根据试样和内标物的质量以称量的试样中，根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积可以求出被测及被测组分和内标物的峰面积可以求出被测组分的含量。组分的含量。%100%100imfAmfAmmisssiissiisifAfAmmsssiifAmfAmi内标物选择准则：内标物选择准则： 试样

32、中不可含有内标物；试样中不可含有内标物； 内标物峰位置与待测组分相近，但相互分离；内标物峰位置与待测组分相近，但相互分离； 内标物加入量应与被测物质相近，峰面积大小相内标物加入量应与被测物质相近，峰面积大小相近。近。 定量校正因子定量校正因子 其定义色谱定量分析是基于峰面积其定义色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。但由于同一检测器对不同与组分的量成正比关系。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的灵敏度不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰灵敏度不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积。或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质面积。或者说，相同的峰面积并