酶的结构与功能

1、.主要内容主要内容主要介绍酶的概念、催化特性及其化学本质，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶的作用机理，进而讨论影响酶作用的主要因素。 重重 点点酶促反应动力学（影响酶反应的因素）；酶的作用机理 难难 点点激活剂、抑制剂的影响；别构调节 .酶的发现及研究历史酶的发现及研究历史 人们对酶的认识起源于生产与生活实践。人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 公元前公元前1212世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴春秋战国时期已知用麴( (曲曲) )治疗消化不良的疾病。治疗消化不良的疾病。

2、酶者，酒母也酶者，酒母也第一节第一节 酶引论酶引论.enzyme (in yeast) enzyme是希腊文是希腊文 en = in ， zyme = yeast.什么是酶？什么是酶？ 酶是生物催化剂酶是生物催化剂 生物体生物体一切生化反应一切生化反应都需酶催化才能进行！都需酶催化才能进行！ 性能远远超过人造催化剂性能远远超过人造催化剂定义：由活细胞产生的、定义：由活细胞产生的、 有高度专一性和有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。高效催化作用的生物大分子。.一、酶是生物催化剂 1.只能催化热力学上允许进行的反应；只能催化热力学上允许进行的反应； 2.提高反应速度，不改变平衡点提高反应速度

3、，不改变平衡点; 3. 只起催化作用，本身不消耗；只起催化作用，本身不消耗； 4. 降低反应的活化能。降低反应的活化能。 （一）与一般催化剂相同的特点（一）与一般催化剂相同的特点.过渡态过渡态. 活化能活化能(activation energy) 指在一定温度下，指在一定温度下，1mol底物全部进入活底物全部进入活化态所需要的自由能化态所需要的自由能 单位：单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能.1. 1. 高效性高效性且且无副反应无副反应反应速度是无酶催化反应速度是无酶催化/ /普通人造催化剂催普通人造催化剂催化反应速度的化反应速度的10105 510101717倍。倍。（二）

4、（二） 生物催化剂的特点生物催化剂的特点.例：双氧水裂解例：双氧水裂解.2.2.专一性专一性Specificity: 酶对催化的反应和反应物有酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。严格的选择性。底物（底物（substrate): 酶作用的物质。酶作用的物质。. （1）酶浓度的可调性）酶浓度的可调性 （2）通过激素调节酶活性）通过激素调节酶活性 （3）反馈抑制调节酶活性）反馈抑制调节酶活性 （4）抑制剂和激活剂）抑制剂和激活剂 （5）别构调控、共价修饰、同工酶等）别构调控、共价修饰、同工酶等 3. 3. 可调节性可调节性 为为P所抑制所抑制 A B C D P（终产物）（终产物） 图图 通过终

5、产物可逆的结合对途径中的第通过终产物可逆的结合对途径中的第1个酶反馈抑制个酶反馈抑制 .4.4.反应条件温和（易失活）反应条件温和（易失活）常温、常压、中性常温、常压、中性5.5.催化活性与结构有关催化活性与结构有关 生物固氮：生物固氮：工业氨合成：工业氨合成：N2+3H2 500 ,300大气压大气压Fe2NH3.二、酶的化学本质及组成经酸碱水解终产物是经酸碱水解终产物是AAAA能被蛋白酶水解而失活能被蛋白酶水解而失活酶可变性失活酶可变性失活酶是两性电解质酶是两性电解质具有不能通过半透膜等胶体性质具有不能通过半透膜等胶体性质具有蛋白质的化学呈色反应具有蛋白质的化学呈色反应化学本质是蛋白质化学

6、本质是蛋白质（一）酶的化学本质（一）酶的化学本质.1982年年T.Cech发现了第发现了第1个有催化活性个有催化活性的天然的天然RNAribozyme（核酶），（核酶），以后又陆续发现了真正的以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。催化剂。19951995年，年，Jack W. Szostak Jack W. Szostak 研究室首先报研究室首先报道了具有道了具有DNADNA连接酶活性的连接酶活性的DNADNA片段，称之片段，称之为为脱氧核酶脱氧核酶( (deoxyribozyme) )，为生物催，为生物催化剂的发展作出了新的贡献。化剂的发展作出了新的贡献。.单纯酶单纯酶 ：只有蛋白质：只有蛋白

7、质缀合酶（结合酶）：脱辅酶缀合酶（结合酶）：脱辅酶 + + 辅助因子辅助因子（prosthetic group） （coenzyme） 全酶全酶（二）酶的化学组成（二）酶的化学组成根据酶的根据酶的组成成份：组成成份： 羧肽酶.NADPH脱氢酶的辅酶过氧化氢酶. 缀合酶中：缀合酶中： 单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性 一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合 同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合 .酶蛋白：决定反应的专一性辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用.monomeric enzyme：一般由

8、一条肽链组成：一般由一条肽链组成oligomeric enzyme：为寡聚蛋白，：为寡聚蛋白，2个亚基个亚基multienzyme complex：几种酶靠非共价键：几种酶靠非共价键 彼此嵌合而成。酶催化将底物转化为产物彼此嵌合而成。酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应的一系列顺序反应, 有利于提高酶的催化效率有利于提高酶的催化效率并便于对酶的调控。并便于对酶的调控。 （如糖代谢、脂代谢）（如糖代谢、脂代谢）（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据酶蛋白分子的特点：根据酶蛋白分子的特点：.三、酶的命名和分类（一）习惯命名法（一）习惯命名法根据其催化底物来命名；根据

9、其催化底物来命名；根据所催化反应的性质来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名，结合上述两个原则来命名，有时在这些命名基础上加上酶的来源有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。或其它特点。（略讲）（略讲）. 优点优点 命名简单命名简单应用历史较长，使用方便应用历史较长，使用方便 缺点缺点一名数酶、一酶数名一名数酶、一酶数名 为了适应酶学发展的新情况，国际酶为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于学会议于19611961年提出一个新的系统命年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会名法及分类原则，已被国际生化协会采用。采用。.（二）国际系统命名法：（二）国际系统命

10、名法： 系统名称包括底物名称、反应性质，系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字最后加一个酶字。. 底物底物1 ：底物：底物2 + 反应性质反应性质+酶酶 乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶当底物为水时，可省略当底物为水时，可省略.I 系统名系统名：包括所有底物的名称和反应类型。包括所有底物的名称和反应类型。乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶I 惯用名惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶

11、乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。.（三）国际系统分类编号（三）国际系统分类编号G 1961 1961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（Enzyme Enzyme Committee, ECCommittee, EC）根据酶所催化的反）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成应类型和机理，把酶分成6 6大类：大类：. 氧化氧化- -还原酶催化氧化还原酶催化氧化- -还原反应，催化氢的转还原反应，催化氢的转移或电子传递。移或电子传递。 主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrog

12、enase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。 如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1 1、氧化还原酶、氧化还原酶 OxidoreductaseOxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADHAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（四）六大类酶的特征（四）六大类酶的特征.（1）脱氢酶类）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应：催化直接从底物上脱氢的反应AH2 +BA +BH2（需辅酶（需辅酶或辅酶或辅酶）（2）氧化酶类）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成催

13、化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需（需FAD或或FMN）催化底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2.（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺（顺，顺-已二烯二酸）已二烯二酸）RH + O2 + 还原型辅助因子还原型辅助因子ROH + H2O + 氧化型辅助因子氧化型辅助因子（又称（又称羟化酶羟化酶）. 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分

14、子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 根据根据X X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 例如，例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2 2、转移酶、转移酶 TransferaseTransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHOAX + BA +BX. 水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶

15、、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：3 3、水解酶、水解酶 hydrolasehydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHAB + H2OAOH + BH. 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。4 4、裂合酶、裂

16、合酶 LyaseLyaseHOOCCH=CHCOOH H2OHOOCCH2CHCOOHOH. 异构酶催化各种同分异构体的相互转化，异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如，例如，6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应磷酸葡萄糖异构酶催化的反应5 5、异构酶、异构酶 IsomeraseIsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOHABPP. 合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类键的形成反应

17、。这类反应必须与反应必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸丙酮酸 + + COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸6 6、合成酶、合成酶 Ligase or SynthetaseA + B + ATPAB + ADP +Pi.酶的系统编号酶的系统编号：4 4位数字位数字第一位：代表六大类反应类型第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物第三位：亚亚类（精确表示底物/ /产物的性质）产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号第四位：在亚亚类中

18、的序号乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号.指酶对底物的选择性，也称特异性。指酶对底物的选择性，也称特异性。结构专一性结构专一性立体专一性立体专一性绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性基团专一性基团专一性键专一性键专一性旋光异构专一性旋光异构专一性（D-D-、L-L-）几何异构专一性几何异构专一性( (顺、反异构顺、反异构) )四、酶的专一性（一）酶的专一性（一）酶的专一性.基团专一性基团专一性胰蛋白酶胰蛋白酶.（1）锁钥学说锁钥学说刚性构象刚性构象（2）诱导契合学说诱导契合学说（3

19、）三点附着学说三点附着学说 立体异构专一性的酶立体异构专一性的酶（二）与酶专一性有关的学说（二）与酶专一性有关的学说.锁钥学说锁钥学说 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样“三点结合三点结合”的催化理论的催化理论 酶与底物的结酶与底物的结合处至少有三合处至少有三个点，而且只个点，而且只有一种情况是有一种情况是完全结合的形完全结合的形式。只有这种式。只有这种情况下，不对情况下，不对称催化作用才称催化作用才能实现。能实现。.诱导契合

20、学说诱导契合学说 酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状是由于底物的诱导才形成了互补形状. . （Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。物互补契合的正确空间位置，有利于催化。.（三）研究酶的专一性的意义（三）研究酶的专一性的意义 理论上理论上，专一性弱键和结构互补成为理，专一性弱键和结构互补成为理解生物大分子之间相互作用的基石。解生物大分子之

21、间相互作用的基石。 实践上实践上也有重要意义。例如，某药物具有某也有重要意义。例如，某药物具有某一种构型才有生理效用，而有机合成的是消旋混一种构型才有生理效用，而有机合成的是消旋混合物合物, , 若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分, ,即得到单一构型的药物。即得到单一构型的药物。. 五、酶的活力测定和分离纯化（一）（一） 酶活力与酶促反应速度酶活力与酶促反应速度1 1、酶活力（、酶活力（enzyme activityenzyme activity） 酶活力就是酶活力就是酶催化某一化学反应的能力。酶催化某一化学反应的能力。可以用它催化某一化学反应的可以用它催

22、化某一化学反应的速度速度来表示。来表示。 酶活力的大小代表酶的量酶活力的大小代表酶的量 .2.2.活力单位活力单位 (U) (U) 酶单位（酶单位（U）：）： 在一定条件下、一定时间内、将一定量的在一定条件下、一定时间内、将一定量的 底物转化为产物所需的酶量。底物转化为产物所需的酶量。如：如： 每小时催化每小时催化1 1克底物克底物 每小时催化每小时催化1 1ml某浓度溶液某浓度溶液 每分钟催化每分钟催化1 1ug底物底物一定时间一定时间一定量底物一定量底物一定条件下一定条件下. 在在标准条件标准条件下（下（25 ，最适，最适pH和最适底和最适底物浓度）物浓度）一分钟一分钟内催化内催化1微摩尔

23、微摩尔底物底物转化转化为产物所需的酶量。为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力单位标准化酶活力单位标准化（1）国际单位（）国际单位（IU）. 在在标准条件标准条件下（下（25 ，最适，最适pH和最适底物浓和最适底物浓度）度）每秒钟每秒钟催化催化1摩尔摩尔底物底物转化为产物所需的转化为产物所需的酶量。酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60106 IU = 6107 IU 1IU =（1/60）Kat = 16.7nKat 酶活力单位标准化酶活力单位标准化（2）Kat.每每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。酶蛋白所含的酶活力单位数。 U/mg酶蛋白酶蛋白、 U/ml酶蛋

24、白酶蛋白酶产品质量评价中常使用，一定程酶产品质量评价中常使用，一定程度上度上代表酶的纯度。代表酶的纯度。（3 3）比活力）比活力 (specific activity)比活力越大，酶的纯度越高比活力越大，酶的纯度越高.一定条件下：一定条件下：w每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数w或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数w一秒内一秒内1摩尔的酶可催化几摩尔的底物摩尔的酶可催化几摩尔的底物 （4 4）转换数）转换数（turnover number，TN） 反应酶的反应酶的催化活性中心催化活性中心的活性的活性 .用哪一个速度来表示酶促反用

25、哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？应的速度特征呢？反应初速度反应初速度 Vo逐渐降逐渐降低低酶反应进程曲线酶反应进程曲线在酶促反应开始无任何干扰因素出在酶促反应开始无任何干扰因素出现时现时, , 短时间内酶的反应速度。短时间内酶的反应速度。一般指一般指反应底物消耗反应底物消耗5%5%以内以内时的反时的反应速率应速率 。3. 酶促反应速度酶促反应速度单位时间内底物单位时间内底物(S)(S)的减少量或产物的减少量或产物(P)(P)的增加量的增加量Why?.反应速度逐渐降低的原因：反应速度逐渐降低的原因：底物浓度的降低；底物浓度的降低； 产物的生成逐渐增大了逆反应；产物的生成逐渐增大了逆反应；

26、酶在反应酶在反应中失活；中失活； 产物对酶的抑制产物对酶的抑制 10 20 30 40 50 60 （min）产物生成量产物生成量酶反应进程曲线酶反应进程曲线反应初速度表示酶活力反应初速度表示酶活力.（二）酶活力的测定（二）酶活力的测定酶反应速度的测量酶反应速度的测量测量单位时间内测量单位时间内底物底物的消耗量。的消耗量。测量单位时间内测量单位时间内产物产物的生成量。的生成量。浓度浓度时间时间产物产物P反应物反应物S.（1 1）应测）应测反应初速度反应初速度（initial velocityinitial velocity） 底物浓度变化在底物浓度变化在起始浓度起始浓度5%5%以内以内。 （2

27、 2）酶的反应速度一般用单位时间内）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增产物的增 加量加量来表示。来表示。 （3 3）测酶活力时应使反应温度、）测酶活力时应使反应温度、pHpH、离子强度和、离子强度和底物浓度等底物浓度等因素保持恒定因素保持恒定。 （4 4）测定酶反应速度时，应使）测定酶反应速度时，应使SESE。 1 1、测定酶活力的注意事项、测定酶活力的注意事项 .2 2、 酶活力的测定方法酶活力的测定方法（1 1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometryspectrophotometry） 该法要求酶的该法要求酶的底物和产物底物和产物在紫外或可见光部分在紫外或可见光部分

28、光吸收不同光吸收不同。 优点：简便、迅速、准确；一个样品可优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测多次测定定；可检测到；可检测到1010-9-9mol/Lmol/L水平的变化。水平的变化。例例: : 人血清乳酸脱氢酶活力的测定人血清乳酸脱氢酶活力的测定 L-L-乳酸乳酸 + NAD+ NAD+ + 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ NADH + H+ + 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶.（2 2）荧光法（）荧光法（fluorometryfluorometry） 该法要求酶反应的该法要求酶反应的底物或产物有荧光底物或产物有荧光变化。变化。 主要的优点：灵敏度很高，可测主要的优点：灵敏度很高，可测101

29、0-12-12mol/Lmol/L的样的样品。品。 酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的TyrTyr、TrpTrp、PhePhe残基以及一些残基以及一些辅酶、辅基，如辅酶、辅基，如NADH NADPHNADH NADPH、FMNFMN、FADFAD等都等都能发出荧光。能发出荧光。 例：乙醇例：乙醇 + NAD+ NAD+ + 乙醛乙醛 + NADH + H+ NADH + H+ + 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶.（3 3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay)(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两第一个酶的产物为第二个酶的底物，这

30、两个酶系统在一起反应。个酶系统在一起反应。 2P 2E1P 1E S P P1 1无光吸收或荧光变化无光吸收或荧光变化，偶联后，偶联后, , P P2 2有光吸有光吸收或荧光变化收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性例：测己糖激酶的活性 葡萄糖葡萄糖 + ATP + ATP 葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸 + ADP + ADP 己糖激酶己糖激酶葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸 + NADP + NADP 葡糖酸葡糖酸-6-6-磷酸磷酸 + NADPH + H+ NADPH + H+ + G-6-PG-6-P脱氢酶脱氢酶.（4 4）电化学法（）电化学法（electrochemical methodelect

31、rochemical method） 有有pHpH测定法、测定法、离子选择性电极法离子选择性电极法等。等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子离子浓度浓度的变化的变化或气体的变化或气体的变化（如（如O O2 2、COCO2 2、NHNH3 3等）。等）。 例例: : 葡萄糖氧化酶活性的测定葡萄糖氧化酶活性的测定 葡萄糖葡萄糖+O+O2 2+H+H2 2O O 葡糖酸葡糖酸+H+H2 2O O2 2 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（5 5）同位素法）同位素法放射性放射性同位素标记底物同位素标记底物，经酶作用得到相应产物，经酶作用得到相应产物，经适当分离，

32、经适当分离，测定产物脉冲数测定产物脉冲数即可。即可。 .酶活力测定实例酶活力测定实例确定反应条件确定反应条件 20、pH=7，底物浓度，底物浓度 6g/l（过量），（过量）， 加入加入2mg固体脂肪酶固体脂肪酶确定活力单位确定活力单位 每小时催化每小时催化1 1克底物克底物 1u= 1g/h 测反应初速度测反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，作产物甘油随时间增加的曲线， 量出反应初速度值量出反应初速度值 ， 换算为脂肪的消耗速度。如换算为脂肪的消耗速度。如 8g/h换算活力换算活力 8g/h 1g/h=8u计算比活计算比活 8u/2mg酶蛋白酶蛋白=4u/mg酶蛋白酶蛋白脂肪酶脂肪酶.分离

33、纯化方法同蛋白质纯化类似：分离纯化方法同蛋白质纯化类似：1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料选材：酶含量丰富的新鲜生物材料2.细胞破碎：因材料而异细胞破碎：因材料而异3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提4.分离及纯化：粗分级，细分级分离分离及纯化：粗分级，细分级分离5. 结晶结晶6.保存：低温下酶粉可长期保存保存：低温下酶粉可长期保存注意低浓度酶溶液易变性注意低浓度酶溶液易变性（三）酶的分离和纯化（三）酶的分离和纯化.酶的分离纯化酶的分离纯化溶溶解解度度的的差差异异盐析法盐析法PEGPEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法热稳定性的差

34、异热稳定性的差异热处理沉淀法热处理沉淀法.电荷性质的差异电荷性质的差异离子交换层析法离子交换层析法电泳法电泳法分子大小和分子大小和形状的差异形状的差异凝胶过滤法凝胶过滤法超滤法超滤法透析法透析法离心法离心法亲和力的差异亲和力的差异亲和层析法亲和层析法疏水作用的差异疏水作用的差异疏水层析法疏水层析法分配系数的差异分配系数的差异双水相系统萃取法双水相系统萃取法.由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : :1 1全部操作在低温全部操作在低温0 044。 2 2在分离提纯过程中，在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌不能剧烈搅拌。 3 3在提纯溶剂中在提纯溶剂中加一些保护剂加一

35、些保护剂，如少量，如少量EDTAEDTA、 少量少量-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。 4 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率）。回收率（得率）。 .酶的纯度：酶的纯度：= = 活力单位数活力单位数/ mL/ mL酶液酶液总体积（总体积（ mLmL） = = 活力单位数活力单位数/ / 毫克蛋白毫克蛋白 = = 每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力= = 100100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝

36、胶电泳法、等电聚焦酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、分子筛层析等。电泳法、分子筛层析等。.衡量分离提纯效果的两个指标衡量分离提纯效果的两个指标总活力的回收总活力的回收得率得率（回收率）（回收率） 是表示提纯过程中酶的损失情况是表示提纯过程中酶的损失情况比活力提高的倍数比活力提高的倍数 是表示提纯方法的有效程度是表示提纯方法的有效程度.酶的分离纯化过程中一定酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性要随时追踪酶的活性.六、六、非蛋白质生物催化剂非蛋白质生物催化剂核酶（核酶（ribozyme)ribozyme) 19821982年美国科学家年美国科学家AltmanAltman和和C

37、echCech研究研究Tetrahymena thermophieaTetrahymena thermophiea（ 嗜热四膜虫）嗜热四膜虫） rRNArRNA前体加工成熟时，发现具有催化活性前体加工成熟时，发现具有催化活性（自我剪切功能）的天然（自我剪切功能）的天然RNARNA。19831983年美国年美国S.AltmanS.Altman等研究等研究 E.coli RNasePE.coli RNaseP（由（由23%23%蛋白质和蛋白质和77%77%的的RNARNA组成），发现组成），发现RNasePRNaseP中中的的RNARNA可催化可催化E.coli tRNAE.coli tRNA的前

38、体的前体加工。加工。 （一）核酶的发现（一）核酶的发现. 1986 1986年，年，T. CechT. Cech又发现又发现 L19 RNA L19 RNA 在一在一定的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸定的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸底物的切割与连接。底物的切割与连接。 基于基于CechCech和和AltmanAltman的创造性工作，将这的创造性工作，将这类具有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质类具有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质而是而是RNARNA的生物大分子定义为的生物大分子定义为RibozymesRibozymes。 该发现曾被认为是生化领域内最令人鼓该发现曾被认为是生

39、化领域内最令人鼓舞的发现之一，为此舞的发现之一，为此CechCech和和AltmanAltman共同荣获共同荣获19891989年度年度诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。.随后的研究表明：随后的研究表明： L19RNAL19RNA具备酶促催化的几个特征：具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性高度的底物专一性 遵循遵循Michaelis-MentenMichaelis-Menten动力学动力学 对竞争性抑制剂的敏感性对竞争性抑制剂的敏感性. (2) 1992 (2) 1992年，年，PiccirilliPiccirilli等发现等发现L19RNAL19RNA具具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。有

40、氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA(3) L19RNA还有限制性内切酶作用：还有限制性内切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU +GpN -CpUpCpU +GpN . (4) 1997 (4) 1997年，年，ZhangZhang和和CechCech用人造的用人造的RNARNA分分子催化合成了肽链，表明子催化合成了肽链，表明RNARNA具有肽基转移酶具有肽基转移酶活性。活性。 (5) (5) 原核生物原核生物RNasePRNaseP和兔肌和兔肌1 1，4- 4- - -葡聚葡聚糖分枝酶糖分枝酶均包括均包括RNA+蛋白组

41、分，蛋白组分，起催化作用的都是起催化作用的都是RNA。.（二）核酶的种类（二）核酶的种类 自我剪切自我剪切: :是转录后加工方式之一是转录后加工方式之一 （self- cleavageself- cleavage） 自我剪接自我剪接: : （self-splicingself-splicing） I I型内含子：需要鸟苷型内含子：需要鸟苷和和MgMg2+2+参与参与II型内含子：不需要型内含子：不需要鸟苷的参与鸟苷的参与剪切与连接剪切与连接催化催化分子内分子内反应反应催化催化分子间分子间反应：反应：按按作用底物作用底物 如如RNase PRNase P、L19RNA L19RNA .自我剪切核

42、酶包括：发夹结构核酶、锤头结构自我剪切核酶包括：发夹结构核酶、锤头结构核酶、丁型肝炎病毒（核酶、丁型肝炎病毒（HDVHDV）核酶等。）核酶等。（1）发夹结构核酶发夹结构核酶由由4 4个螺旋区和数个环状区组成个螺旋区和数个环状区组成 切割活性所需最小长度为切割活性所需最小长度为5050个核苷酸个核苷酸螺旋螺旋、决定核酶切割部位的特异决定核酶切割部位的特异性，螺旋性，螺旋配对碱基及其配对碱基及其33端的未配端的未配对碱基均为切割活性所必需对碱基均为切割活性所必需 结构特点结构特点.结构特点结构特点 三个螺旋三个螺旋 1313个保守碱基个保守碱基 剪切点：剪切点：GUN GUN （2 2）锤头结构核

43、酶）锤头结构核酶 （3 3）HDVHDV核酶和核酶和VS RNA VS RNA .（三）核酶的研究意义与应用前景（三）核酶的研究意义与应用前景1 1、研究意义、研究意义 突破了生物体内所有的突破了生物体内所有的“生物催化剂都是蛋白质生物催化剂都是蛋白质”的的传统观念；传统观念；对生命起源这一问题有了新的认识对生命起源这一问题有了新的认识 ；从生物进化角度来看，生物催化剂从核酶到蛋白质的从生物进化角度来看，生物催化剂从核酶到蛋白质的转变，伴随着生物代谢高效率和生命现象的更趋复杂。转变，伴随着生物代谢高效率和生命现象的更趋复杂。 .2 2、应用前景、应用前景 可以设计出自然界不存在的各种核酶。可以

44、设计出自然界不存在的各种核酶。 核酶基因研究前景诱人，在基因治疗领域中倍核酶基因研究前景诱人，在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。受青睐，其研究进展也相当迅速。 . 酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括：需产品的一项技术。包括：( (酶学酶学+ +化学工程技术化学工程技术) ) 利用化学工程手段，改善酶的性能，提高催化效率利用化学工程手段，改善酶的性能，提高催化效率, , 降低成本。包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶、降低

45、成本。包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶、人工酶人工酶：( (酶学酶学+ +现代分子生物学技术现代分子生物学技术) ) 以以DNADNA重组技术为核心。包括：克隆酶、突变酶等。重组技术为核心。包括：克隆酶、突变酶等。.w化学酶工程化学酶工程 酶酶分子表面分子表面的修饰，酶的修饰，酶分子内部分子内部的修饰，的修饰，化学合成人工酶化学合成人工酶 。1、微生物发酵得到粗酶、微生物发酵得到粗酶2、对天然酶进行、对天然酶进行化学修饰化学修饰、固定化处理固定化处理， 利用利用化学合成化学合成等手段来改善酶性能。等手段来改善酶性能。天然酶天然酶 . 利用化学的手段对酶分子上的利用化学的手段对酶分子上的氨基酸

46、侧链基氨基酸侧链基团团进行修饰，改善酶的性能，进行修饰，改善酶的性能，以适用于以适用于工业工业的的应用及研究工作的要求。应用及研究工作的要求。1、酶化学修饰的基本方法、酶化学修饰的基本方法 （1）酶分子侧链基团的化学修饰）酶分子侧链基团的化学修饰 修饰酶的功能基团：修饰酶的功能基团： -NH3、 -SH、 -COOH 、咪唑基、咪唑基、酚羟基、吲哚基、胍基、甲硫基等。酚羟基、吲哚基、胍基、甲硫基等。修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。芳香环取代反应等类型。（一）化学修饰酶（一）化学修饰酶. 其中水溶性的碳二亚胺类

47、其中水溶性的碳二亚胺类 特定修饰已成为最普遍的特定修饰已成为最普遍的标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下，标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下，SerSer、CysCys和和TyrTyr也可反应。也可反应。羧基的修饰羧基的修饰OENZCOCN+HRN+HRENZOCON+NCRRHOENZCXOCN+HRN+HR+ H+pH5HX（卤素）（卤素）H+R,R为烷基，为烷基，HX 为卤素、一级或二级胺；为卤素、一级或二级胺；ENZ为酶为酶. LysLys的的-NH-NH2 2可采用烷基化反应来修饰。修饰剂包括可采用烷基化反应来修饰。修饰剂包括有有乙酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳

48、香族磺酸乙酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸。其中，三。其中，三硝基苯磺酸（硝基苯磺酸（TNBSTNBS）是种非常有效的氨基修饰剂。反应）是种非常有效的氨基修饰剂。反应后在后在420nm420nm和和367nm367nm能够产生特定的光吸收。能够产生特定的光吸收。氨基的修饰氨基的修饰O2NO2NNO2HO3S ENZNH2+pH7O2NO2NNO2NH ENZ. 此外，磷酸吡哆醛（此外，磷酸吡哆醛（PLPPLP）、氰酸盐、及蛋白质）、氰酸盐、及蛋白质测序中用的测序中用的DNSDNS（丹磺酰氯）、苯异硫氰酸酯（丹磺酰氯）、苯异硫氰酸酯（PITCPITC）都可作为修饰剂。都可作为修饰剂。ENZNH

49、2+SO2ClN(CH3)2ENZNHSO2N(CH3)2+Cl-H+丹磺酰氯丹磺酰氯. 具有两个邻位羟基的化合物。如丁二酮、具有两个邻位羟基的化合物。如丁二酮、1 1，2-2-环环己二酮、苯异二醛，都是重要的修饰剂。己二酮、苯异二醛，都是重要的修饰剂。胍基的修饰：胍基的修饰：ENZNCNH2NH2OO+NCENZNH NHOH OH硼酸盐硼酸盐NCENZNH NH O OBOH OH. 烷基化试剂是一种酶修饰剂，如碘乙酸。修饰产物相当稳定，烷基化试剂是一种酶修饰剂，如碘乙酸。修饰产物相当稳定，易于分析。此外，马来酸酐、马来酰亚胺等修饰剂与巯基形成对易于分析。此外，马来酸酐、马来酰亚胺等修饰剂

50、与巯基形成对酸稳定的衍生物。酸稳定的衍生物。 2-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（DTNBDTNB），与），与-SH-SH反应形成反应形成S-SS-S，释放出一个，释放出一个2-2-硝硝基基-5-5-硫苯甲酸阴离子。在硫苯甲酸阴离子。在412nm412nm处有最大吸收。因而能通过光吸处有最大吸收。因而能通过光吸收的变化跟踪反应程度。收的变化跟踪反应程度。巯基的修饰巯基的修饰5,55,5- -二硫代二硫代- -（2-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（DTNBDTNB）ENZNO2COO-SSENZSH+-OOCO2NSSNO2COO-NO2COO-SpHpH6.86.8有机汞试剂（如对氯汞苯甲酸）对巯基专

51、一性强，反应物在有机汞试剂（如对氯汞苯甲酸）对巯基专一性强，反应物在250nm处有吸收处有吸收. 常用的修饰剂有，焦碳酸二乙酯（常用的修饰剂有，焦碳酸二乙酯（DPCDPC）、碘代乙酸，）、碘代乙酸，能修饰咪唑基的两个能修饰咪唑基的两个N N原子。原子。NNHENZENZNNCH2COO+ CH3CH2OH + CO2HisHis咪唑基的修饰咪唑基的修饰ONNHENZCOCOOCH2CH3OCH2CH3NNENZOCOCH2CH3+pH4-7ICH2COO-pH5.5. TrpTrp残基一般位于残基一般位于E E分子内部，而且比分子内部，而且比-SH-SH、-NH-NH2 2等一些亲等一些亲核基

52、团的反应性差。所以一般不与常用的一些试剂反应。核基团的反应性差。所以一般不与常用的一些试剂反应。 N-N-溴代琥珀酰亚胺（溴代琥珀酰亚胺（NBSNBS）可以修饰，并通过）可以修饰，并通过280nm280nm处光吸收处光吸收的减少跟踪反应。的减少跟踪反应。色氨酸吲哚基的修饰色氨酸吲哚基的修饰. TyrTyr的修饰包括的修饰包括-OH-OH和芳环上的取代修饰，和芳环上的取代修饰，ThrThr和和SerSer残残基的基的-OH-OH都可被酚羟基的修饰剂修饰，但反应条件严格些，都可被酚羟基的修饰剂修饰，但反应条件严格些，生成的产物也更稳定。生成的产物也更稳定。 四硝基甲烷（四硝基甲烷（TNMTNM）在

53、温和条件下可高度专一性地硝化）在温和条件下可高度专一性地硝化酚羟基生成可电离的发色基团酚羟基生成可电离的发色基团3-3-硝基酪氨酸，在酸水解条件硝基酪氨酸，在酸水解条件下稳定，可用于氨基酸定量分析。下稳定，可用于氨基酸定量分析。酪氨酸残基和脂肪族酪氨酸残基和脂肪族羟基羟基的修饰的修饰.甲硫氨酸甲硫基的修饰甲硫氨酸甲硫基的修饰ENZSCH3+H2O2ENZSCH3H2O+OpH5ENZSCH3+2HCOOHOENZSCH3+OH2HCOHOO约约-10-10过甲酸过甲酸ENZSCH3+ICH2CNH2OENZS+OpH4pH4CH3CH2CNH2I-甲硫基的化学修饰甲硫基的化学修饰碘乙酰胺碘乙酰

54、胺 甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下很难选择性修饰。甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原子具有亲和性，可以用过氧化氢、过甲酸但是由于硫醚的硫原子具有亲和性，可以用过氧化氢、过甲酸等氧化成甲硫氨酸亚砜。等氧化成甲硫氨酸亚砜。.（2 2）酶的化学交联）酶的化学交联 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。应。同型双功能交联剂同型双功能交联剂: :两端具有相同的活性反应基团。可与氨基两端具有相同的

55、活性反应基团。可与氨基反应的双亚氨酸酯是一个典型的同型双功能交联剂。此外，反应的双亚氨酸酯是一个典型的同型双功能交联剂。此外，N N羟琥珀酰亚氨酯、二硝基氟苯等。羟琥珀酰亚氨酯、二硝基氟苯等。异型双功能交联剂：异型双功能交联剂：一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用。一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用。但是用碳二亚胺时，第二个反应基团是羧基。但是用碳二亚胺时，第二个反应基团是羧基。可被光活化的高交联剂：可被光活化的高交联剂：一端与酶反应后，经光照，另一端产一端与酶反应后，经光照，另一端产生一个活性反应基团（自由基）如碳烯或氮烯，它们具有高反生一个活性反应基团（自由基）如碳烯或氮烯，它们具有高反

56、应性，没有专一性。应性，没有专一性。. 使用双功能试剂如戊二醛、使用双功能试剂如戊二醛、PEGPEG等可将酶蛋白分子之间等可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链之间进行共价交联，使、亚基之间或分子内不同肽链之间进行共价交联，使酶分子活性结构得以加固，提高其稳定性。酶分子活性结构得以加固，提高其稳定性。 交联酶晶体技术可以大幅度提高酶的生物活性和热稳交联酶晶体技术可以大幅度提高酶的生物活性和热稳定性。并且发现交联晶体在有机溶剂中的催化活性和定性。并且发现交联晶体在有机溶剂中的催化活性和稳定性提高。稳定性提高。例如，糖基化作用于交联技术联合使用应用于青霉素例如，糖基化作用于交联技术联合使用应

57、用于青霉素G G酰化酶，酰化酶，利用葡聚糖二乙醛将青霉素利用葡聚糖二乙醛将青霉素G G酰化酶交联，酰化酶交联，55 55 下半衰期下半衰期提高提高9 9倍，倍，Vmax Vmax 不变。不变。此外，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通过交联修饰由常温酶此外，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通过交联修饰由常温酶变为嗜热酶，温度从变为嗜热酶，温度从45 45 提高到提高到7676. 对修饰剂的要求：对修饰剂的要求：修饰剂具有较大的相对分子质修饰剂具有较大的相对分子质量，良好的生物相容性；分子表面有较多地反应活性基量，良好的生物相容性；分子表面有较多地反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。团及修饰后酶活的半衰

58、期较长。（3 3）大分子结合修饰）大分子结合修饰常用的化学修饰剂常用的化学修饰剂A A、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖等；葡聚糖等； B B、高分子聚物聚乙二醇（、高分子聚物聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯醇）、聚乙烯醇 （PVAPVA）、聚）、聚N N 乙烯吡咯烷酮（乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、聚丙烯酸（）、聚丙烯酸（PAAPAA）等；）等； C C、生物大分子常用的有肝素、血浆蛋白、聚氨基酸类等；蛋、生物大分子常用的有肝素、血浆蛋白、聚氨基酸类等；蛋白质或其他大分子物质等白质或其他大分子物质等. 大分子多聚物

59、与具有生物活性的大分子物质通过共价大分子多聚物与具有生物活性的大分子物质通过共价键将大分子连接到酶分子表面，使之在酶的表面形成键将大分子连接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆盖层，从而使酶的性质产生改变。覆盖层，从而使酶的性质产生改变。 大分子在使用前要进行活化，方法有：溴化氢法、高大分子在使用前要进行活化，方法有：溴化氢法、高碘酸氧化法、叠氮法、三氯均三嗪法等碘酸氧化法、叠氮法、三氯均三嗪法等NH2+酶酶NH2COOHCOOHRN=C=NRCNHOCNH酶酶OO白蛋白与酶之间以羰二亚胺作为交联剂的修饰反应白蛋白与酶之间以羰二亚胺作为交联剂的修饰反应（修饰酶）（修饰酶）CNH酶酶酶酶.分子量在

60、分子量在500-20 000 500-20 000 聚乙二醇类修饰剂应用最聚乙二醇类修饰剂应用最广，其生物相容性通过广，其生物相容性通过FDAFDA认证。其分子末端有认证。其分子末端有两个能被活化的羟基。分子修饰时多采用单甲氧两个能被活化的羟基。分子修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（基聚乙二醇（MPEGMPEG） MPEGMPEG均三嗪衍生物均三嗪衍生物 MPEGMPEG琥珀酰亚胺类衍生物琥珀酰亚胺类衍生物 MPEGMPEG氨基酸类衍生物氨基酸类衍生物肝素肝素含硫酸酯的粘多糖及适用于用来修饰溶含硫酸酯的粘多糖及适用于用来修饰溶解血栓酶类，增加酶的疗效。解血栓酶类，增加酶的疗效。. 酶经修饰后会产生