高效液相色谱法测定兽药硫酸粘菌素及其制剂的含量

1、2009年第3湖北畜牧兽医月刊邮发代号 38-352HUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARYSCIENCES硫酸粘菌素（Colistin Sulfate 是由粘杆菌发酵产生的由多种氨基酸和脂肪酸组成的碱性多肽类抗生素，对革兰氏染色阴性菌有很强的 抗菌作用，并且具有高效、低毒、低残留等特点，在畜病防治中主要用于由大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。其含量测 定中国兽药质量标准2003年版规定为生物效价测定方法，但其方法具有操作步 骤复杂,检测周期长,影响因素多等缺点。随着兽药的发展，检验制度的完善，为了满足 生产单位与监督检验机构逐渐增加

2、的检验量，本文利用高效液相色谱法（HPLC检测 原理,建立了快速、准确的HPLC测定兽药硫酸粘菌含量的检测方法。1材料与方法1.1 主要仪器与试剂Waters2690高效液相色谱仪，2487紫外检测器，硫酸粘菌素标准品（购自中国兽医药品监察所乙月青为色谱纯，其余试剂均为分析纯，硫酸 粘菌素原料、可溶性粉和10%硫酸粘菌素预混剂均为湖北兴鼎生物制药公司提供（均已用生物效价法测定其含量。1.2 实验方法1.2.1 色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长215nm流速1.0mL /min ,柱温30C ,进样量20仙L 1流动相0.1mol /L无水硫酸钠：乙月青=4 ： 1,用磷酸调酸碱度至

3、pH2.4。 1.2.2测定方法分别取标准品和样品适量，精密称定，置相应的容量瓶中用流动相稀释至刻度，摇匀，分别制成含粘菌素0.5mg /mL的待 测工作液，预混剂按规格精密称取适量加流动相适量超声助溶 5min，冷却，定容至刻 度，同法测定，记录色谱图14。2结果分析2.1方法适用性试验收稿日期：2009-02-05作者简介:朱曦（1974-,女，安徽定远人，助理工程师，主要从事兽药、畜产品、饲料检验及微生 物发酵工程工作，（电tS 027-*（ 电子信箱zhuxi。高效液相色谱法测定兽药硫酸粘菌素及其制剂的含量朱曦,田慧云，徐军（湖北省兽药监察所，武汉430070摘要:应用高效液相色谱法（

4、HPLC进行检测，在色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶 为填充剂，柱温306C ,流动相:无水硫酸钠（0.1mol /L :乙月青=80 : 20以磷酸调pH 至2.4 81,检测波长215nm进样量20 L的条彳下，硫酸粘菌素峰与杂质峰分离良好 变异系数（RSD小于1.5%。结果表明，HPLC法能快速、准确的测定兽药硫酸粘菌素 的含量，并能够满足兽药硫酸粘菌素其他剂型的含量测定。关键词：硫酸粘菌素；高效 液相色谱;含量测定中图分类号：S859.79;O657.7+2文献标识码：A文章编号:1007-273X （200903-0007-02图4预混剂图谱图1标准品图谱图2原料药图谱图3可溶性粉图谱时

5、间/min时间/min时间/min时间/minA UA UA UAU82009年第3期15 Acdcmk k，ur）】ul ElcctioniiHUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCES取原料、可溶性粉及预混剂3种样品进行方法适用性实验，每个样品选一个浓度水平，各制备5份，每份进两针，取 其平均值。见图谱14表明5种主要物质的在不同时间出 峰,样品峰保留时间与标准品峰保留时间一致，色谱峰峰形 较好。说明所测物质相同。各峰能完全分离成E1、E2、E3、E1-1、E1-7MOA等5个峰，相邻之间的分离度分别为2450、 8008、4134、185

6、0，表明各峰之间分离良好。积分基线在同一 水平，表明其积分稳定，并且与杂质峰完全分离。各峰系统适 应性良好数据见表1。从表2和表3中根据峰面积所得含量 测定结果与按中国兽药典2005年版一部生物效价法测定 值一致，且最大变异系数（RSD为0.71%,表明其方法影响 因素少，测定结果准确。2.2 线性范围和精密度准确度在该试验条件下硫酸粘菌素标准溶液的浓度在0.1,0.3,0.5,0.7,1.0,1.5,2.0,2.5mg/m L# 取 10pL进样,t 己录色谱图，以浓度（C,mg/mL为横坐标，峰面积（A为纵坐标进 行线性回归，在0.3,0.5,0.7,1.0,1.5mg/mL范围内与峰面积

7、 呈线性相关性，线性回归方程为y=3258710.5x（r=0.9990 以0.500mg/m L硫酸粘菌素标准溶液连续进样10次,峰面积响应值的变异系数为0.4%。回收率:取各样品5个水平与可溶性淀粉相混匀，每个水平做5次重复以检测该方法的回收率，结果见表4,其原料浓度在0.5mg/mL时,原料回收率在98.0%以上，表明本试验过程中样品稳定性好，损失小，准确度高。3结论本试验建立了高效液相色谱法测定兽药硫酸粘菌素的含量，以上结果表明样品溶液与标准品溶液出峰时间一致，积分稳定，与杂质峰完全分离，系统稳定性好，HPLC法能够准确测定兽药硫酸粘菌素及其制剂的含量。HPLC法相对于生物效价法具有快

8、速、准确、简便，能够批量检验等优点。此法适用于兽药硫酸木菌素的各类剂型，缩短了此药在实际生产的检验时间，为兽药生产品质控制提供了有力保障。参考文献：1BRITISH PHARMACOPOEIA COMMISSION.BRITISH PHAR-MACOPOEIA2008VOLUME1M.London:the Stationery Office on B ehalf of the Medicines and Healthcare P roductsRegulatory Agency(MHRA,2007.611-612.名称E2E3E1-1E1E1-7MOAUSP分离度2.450304e+0008.

9、008058e+0004.133778e+0001.850270e+000对称因子1.144555e+0009.885051e-0011.201249e+0001.056013e+0001.025445e+000USP理论塔板数3.792906e+0035.320977e+0034.446904e+0035.189700e+0034.870077e+003表2生物效价法测定结果名称标准品原料预混剂可溶性粉规格/U mg-1213441900010%(30000U/mg19000称样量/mg25.6752.7452.810.33500.337752.6952.72定容体积/mL50.15100.

10、21100.34100.50101.31100.11100.17标示量/%92.7992.1593.0492.5392.1992.98表3HPLC法测定结果样品标小量/%92.4592.6792.1692.0792.49RSD/%0.1样品标小量/%92.9692.1692.7692.3792.2RSD/%0.25样品标小量/%92.1193.3492.5693.7992.48RSD/%0.71硫酸粘菌素原料硫酸粘菌素可溶性粉硫酸粘菌素预混剂表4HPLC法的回收率浓度/mg mL-10.30.50.71.01.5回收率/%98.899.898.196.996.4浓度/mg mL-10.30.5

11、0.71.01.5回收率/%96.598.898.396.295.0浓度/mg mL-10.30.50.71.01.0回收率/%98.098.998.696.395.1硫酸粘菌素原料硫酸粘菌素可溶性粉硫酸粘菌素预混剂【试验研究】母猪产后的卫生处理在母猪生产情况调查中发现，农村母猪饲养户对产后母猪不注意卫生处理，极易引起母猪产后子宫炎、乳房炎、 无乳综合征、产后热、破伤风、产后不食等诸多常见产科疾 病，以致影响其繁殖机能，甚至被淘汰。注意母猪产后卫生 处理，可以大大减少产后诸多病症的发生。方法如下： (1检查胎衣是否完全排出，胎衣数或脐带数是否与产 仔数一致。对胎衣不下的母猪，可肌注乙烯雌酚10

12、mg待子 宫颈扩张以后，每隔30min肌注催产素30万IU,连注23 次。确定胎衣完全排出后，向产道深部投放青霉素80万 160万 IU。(2根据母猪具体情况采取具体消炎措施：初产母猪、7d为一个万IU,每天注射2次。同时可向产道深部灌注温的 0.1%的高钮酸钾溶液，直 至恢复正常为止。对曾有产后患病史的经产母猪，也可按上 述方法处理。对正常顺产的经产母猪，每次按每千克体重 肌注青霉素2万IU,每天注射2次，连续注射2d。消炎后的 母猪，若1周后产道仍有脓液排出，可首先向其子宫内灌注 微温的0.1%的高钮酸钾溶液200300mL，同时肌注乙烯雌 酚5mg使子宫颈扩张；隔30min左右肌注催产素30万IU,间隔30min注射1次，连续注射23次。同时肌注青、链霉素混合液，配