第3章生化(刘建华)

1、BiochemistrySixth EditionChapter 3:Exploring Proteins and ProteomesCopyright 2007 by W. H. Freeman and Company Berg Tymoczko Stryer 奶汁是所有哺乳动物的营养源。奶汁含有不同蛋白质。用MALDI-TOF质谱技术研究奶汁的蛋白质组成，依靠蛋白分子质量/电荷比将奶汁蛋白质各组分分开。1. 几乎在所有的生物过程中，蛋白质都起关几乎在所有的生物过程中，蛋白质都起关键作用。生物化学的主要内容包括蛋白质键作用。生物化学的主要内容包括蛋白质结构和功能，以及蛋白质执行其生物功能结构

2、和功能，以及蛋白质执行其生物功能的分子机制。的分子机制。2. 对蛋白质进行深入研究有赖于纯化蛋白质对蛋白质进行深入研究有赖于纯化蛋白质的获得。有了纯化蛋白，你能确定蛋白质的获得。有了纯化蛋白，你能确定蛋白质序列、测定蛋白质三维结构、制备相应的序列、测定蛋白质三维结构、制备相应的抗体进行细胞定位、分析蛋白质功能、研抗体进行细胞定位、分析蛋白质功能、研究蛋白质执行其功能的机制。究蛋白质执行其功能的机制。3. 可以从说生物信息学数据库获得相关的数可以从说生物信息学数据库获得相关的数据，尤其是序列数据，有助于你的研究。据，尤其是序列数据，有助于你的研究。基因组和蛋白质组基因组和蛋白质组1. 基因组：基

3、因组：一种生物的全基因组序列以及对DNA序列进行的基因注释。基因组信息提供了生物体各种基因，以及这些基因所编码的功能产物。基因组是静态的。2. 蛋白质组：蛋白质组：特定条件下，基因组的蛋白质表达形式。包括该条件下蛋白质种类、结构、修饰、功能、以及蛋白质之间的相互作用等。不同类型的细胞、同一类型不同发育状态的细胞、不同环境的同一类型细胞将有不同的蛋白质组。由于生物修饰蛋白方式多样，因此蛋白质组比基因组大得多。蛋白质组是动态的。研究蛋白质功能的第一步是纯化蛋白质生物化学有个谚语：“别在不纯的蛋白质上别在不纯的蛋白质上浪费你完美的思路。浪费你完美的思路。”建立跟踪目标蛋白的方案：建立跟踪目标蛋白的方

4、案：测活；电泳；标记；测活；电泳；标记；抗体免疫等抗体免疫等蛋白质释放，离心使混合物分级蛋白质释放，离心使混合物分级透析去除小分子透析去除小分子（依据分子大小差异）（依据分子大小差异）凝胶过滤层析凝胶过滤层析 (记住分子越大，流过愈快)。离子交换层析离子交换层析， 依据蛋白质的净电荷差异离子交换层析的介质离子交换层析的介质阳离子交换 阴离子交换亲和层析：亲和层析：依靠配基与蛋白质之间特异的亲和性。HPLC ( (凝胶过滤柱凝胶过滤柱) ) 支持物颗粒细，分离效果好，但需要施加高压才有合理的流速。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳速度 u = Ez/f (1)球状分子 f = 6

5、p h r (2)+ -mercaptoethanol破坏二硫键破坏二硫键每个SDS分子能够结合多肽链的两个氨基酸SDS-PAGE能够测定多肽链的质量。等电聚焦凝胶电泳二二维维凝凝胶胶电电泳泳大大肠肠杆杆菌菌的的二二维维电电泳泳结结果果纯化方案合理性评价（考虑纯化度和回收率）纯化方案合理性评价（考虑纯化度和回收率）超速离心分离大分子、测定大分子质量超速离心分离大分子、测定大分子质量1. 超速离心能分离大分子、测定大分子质量。2. 能够确定大分子形状、密度、质量等参数。3. 研究分子之间的相互作用。 在离心条件下，一个颗粒穿过液相介质的移动速率用沉降系数s表示： s = m (1-n r) /f

6、 其中m是颗粒的质量，n是颗粒的体积（根据颗粒的密度计算)，r是离心介质的密度，f是摩擦系数（颗粒形状的评价参数)。(1-nr)就是离心介质施加给颗粒的浮力。1. 颗粒的沉降速度部分取决于该颗粒的质量质量。如果形状和密度相同，质量越大的颗粒沉降速度愈快。2. 形状也影响沉降速度(因为颗粒的形状会影响颗粒沉降的粘度)。质量和密度相同，球形颗粒摩擦系数小，沉降速度快。3. 质量和形状相同，颗粒密度大，浮力(1-nr)小，其沉降速度快。4. 沉降速度也依赖于溶液密度（r）。溶液r 大，颗粒沉降慢。实际上，nr 1颗粒上浮；当nr = 1颗粒不移动； nr 1颗粒上浮。沉降系数单位是沉降系数单位是Sv

7、edberg单位单位(S)，相当于，相当于10-13s。S值愈小，在离心场移动愈慢。值愈小，在离心场移动愈慢。图图3.14 3.14 细胞组分的密度和沉降系数。细胞组分的密度和沉降系数。制备密度梯度制备密度梯度介质用于密度介质用于密度梯度离心。梯度离心。上样上样水平离心。水平离心。回收已经分离回收已经分离的蛋白质条带的蛋白质条带 离心沉降平衡技术能直接用来测定蛋白质的分子量。此时离心速度较慢使蛋白此时离心速度较慢使蛋白质沉降和蛋白质扩散达到平衡质沉降和蛋白质扩散达到平衡。用离心沉降平衡技术测定的蛋白质质量非常准确非常准确，条件温和、保留多亚基蛋白质天然的四级多亚基蛋白质天然的四级结构。结构。而

8、SDS-PAGE只能提供解离多肽链解离多肽链的质量质量。注意，如果我们既知道一个多聚体蛋白质在变性条件下各个多肽的估算值，也知道沉降平衡离心的完整多亚基蛋白的质量，我们就能够确定该多亚基蛋白各个多肽链的拷贝数。蛋白质氨基酸组成分析蛋白质氨基酸组成分析1. 6N HCl，110oC加热24小时 2. 用离子交换层析分离氨基酸，根据出峰体积确定各氨基酸组分（图3.16）。3. 除了脯氨酸外，用茚三酮处理氨基酸产生深蓝蓝色色（但脯氨酸显黄色黄色)。茚三酮衍生物的光吸收与氨基酸浓度成正比（氨基酸检测极限：1微克或10 nmol，相当于一个指纹的氨基酸含量）。用荧光胺代替茚三酮更灵敏，低至一奈克（10

9、pmol）的氨基酸也可以测出。 洗涤采用洗涤采用pH值逐渐增加的柠檬酸钠溶液。值逐渐增加的柠檬酸钠溶液。荧光胺荧光胺 茚三酮茚三酮 Figure 3.18. The Edman Degradation. The labeled amino-terminal residue (PTH-alanine in the first round) can be released without hydrolyzing the rest of the peptide. Three more rounds of the Edman degradation reveal the complete sequen

10、ce of the original peptide.Figure 3.19. Separation of PTH-Amino Acids. PTH-amino acids can be rapidly separated by HPLC. In this HPLC profile, a mixture of PTH-amino acids is clearly resolved into its components.An unknown amino acid can be identified by its elution position relative to the known on

11、es.Edman降解的降解的长度不能超过长度不能超过50氨基酸。氨基酸。CNBr断裂多肽链的位点：断裂多肽链的位点：Met-XTrypsin断裂多肽链的位点：断裂多肽链的位点：Lys-X Arg-X图3.22 重叠肽段。基于胰凝乳蛋白酶酶切后的肽段与胰蛋白酶酶切后的肽段序列重叠，构建肽段排列顺序。 二硫键交联多肽链的分离二硫键交联多肽链的分离：（1）用还原试剂如）用还原试剂如b b-巯基乙巯基乙醇或醇或DTT处理。处理。（2）然后用碘代乙酸处理）然后用碘代乙酸处理将巯基烷基化形成稳定的将巯基烷基化形成稳定的S-羧甲基衍生物，能够阻止半羧甲基衍生物，能够阻止半胱氨酸重新氧化形成二硫键胱氨酸重新氧

12、化形成二硫键（图（图3.23）。）。 对角线电泳技术对角线电泳技术 (diagonal electrophoresis) ：确定蛋白：确定蛋白质的二硫键位置。第一步在质的二硫键位置。第一步在二硫键保持完整的条件下裂二硫键保持完整的条件下裂解蛋白质。将裂解混合物上解蛋白质。将裂解混合物上样到点用用滤纸的一个角落样到点用用滤纸的一个角落，沿一个方向电泳。第二步，沿一个方向电泳。第二步将滤纸置于过甲酸蒸汽环境将滤纸置于过甲酸蒸汽环境中，二硫键发生断裂生成磺中，二硫键发生断裂生成磺酸类半胱氨酸。采用同样的酸类半胱氨酸。采用同样的条件，在垂直方向电泳。条件，在垂直方向电泳。确定二硫键位置确定二硫键位置蛋

13、白质氨基酸序列用途蛋白质氨基酸序列用途u了解蛋白质结构与功能。了解蛋白质结构与功能。氨基酸序列与序列已知蛋白质进行比较，寻找序列相似性，确定该蛋白质的家族属性。推测该蛋白质的结构与功能。u研究蛋白质进化。研究蛋白质进化。与不同物种的同一蛋白进行序列比较，找出该蛋白质的进化关系。u搜寻内部的序列重复。搜寻内部的序列重复。搜寻蛋白质内部有无重复序列。内部重复能揭示蛋白质本身的进化史。很很多蛋白质是原型基因重复后差异化的结果。多蛋白质是原型基因重复后差异化的结果。u了解了解定位信号定位信号的有无。的有无。u作为抗原制备抗体。作为抗原制备抗体。u基因探针。基因探针。Figure 3.25. Repea

14、ting Motifs in a Protein Chain. Calmodulin, a calcium sensor, contains four similar units in a single polypeptide chain shown in red, yellow, blue, and orange. Each unit binds a calcium ion (shown in green).重组重组DNA技术技术极大地促进蛋白质序列测定。Figure 3.27. Antibody Structure. (A) IgG antibodies consist of four c

15、hains, two heavy chains (blue) and two light chains (red), linked by disulfide bonds. The heavy and light chains come together to form Fab domains, which have the antigen-binding sites at the ends. The two heavy chains form the Fc domain. The Fab domains are linked to the Fc domain by flexible linke

16、rs. (B) A more schematic representation of an IgG molecule.Figure 3.28. Antigen-Antibody Interactions. A protein antigen, in this case lysozyme, binds to the end of an Fabdomain from an antibody. The end of the antibody and the antigen have complementary shapes, allowing a largeamount of surface to

17、be buried on binding.Figure 3.29. Polyclonal and Monoclonal Antibodies. Most antigens have several epitopes. Polyclonal antibodies areheterogeneous mixtures of antibodies, each specific for one of the various epitopes on an antigen. Monoclonal antibodiesare all identical, produced by clones of a sin

18、gle antibody-producing cell. They recognize one specific epitope.Figure 3.30. Preparation of Monoclonal Abs. Hybridoma cells are formed by fusion of antibody-producingcells and myeloma cells. The hybrid cells are allowed to proliferate by growing them in selective medium. They are thenscreened to de

19、termine which ones produce antibody of the desired specificity.Figure 4.31. Fluorescence Micrograph of a Developing Drosophila Embryo. The embryo was stained with afluorescent-labeled monoclonal antibody for the DNA-binding protein encoded by engrailed, an essential gene inspecifying the body plan.F

20、igure 3.32. Indirect ELISA and Sandwich ELISA (A) In indirect ELISA, the production of color indicates the amount of an antibody to a specific antigen. (B) In sandwich ELISA, the production of color indicates the quantity of antigen.测抗体测抗体测抗原测抗原Figure 3.33. Western Blotting. Proteins on an SDS-polya

21、crylamide gel are transferred to a polymer sheet and stained with radioactive antibody. A band corresponding to the protein to which the antibody binds appears in the autoradiogram.Figure 4.34. Actin Filaments. Fluorescence micrograph of actin filaments in a cell stained with an antibody specific to

22、 actin.Figure 3.35. Nuclear Localization of a Steroid Receptor. (A) The receptor, made visible by attachment of the green fluorescent protein, is located predominantly in the cytoplasm of the cultured cell. (B) Subsequent to the addition of corticosterone (a glucocorticoid steroid), the receptor mov

23、es into the nucleus.图图3.36 免疫电子显微免疫电子显微图谱。图谱。神经突触的膜泡有一种通道蛋白，用金粒标记该蛋白的抗体。然后用这种抗体与神经突触结合，在电子显微镜下观察显示金粒结合的抗体聚集，呈直径达150A的不透明颗粒。甲酰甲硫氨酸甲酰甲硫氨酸(fMet)肽肽图图3.37 后叶加压素及合成的后叶加压素类似物。后叶加压素及合成的后叶加压素类似物。后叶加压素能够促进水分重新吸收。后叶加压素结构式（A）和合成的后叶加压素结果类似物（B）。图图3.38 氨基酸活化氨基酸活化。二环己基碳二亚胺（DCCI）用来活化氨基酸的羧基。图图3.39 多肽的固相合成。多肽的固相合成。固相合

24、成的步骤是：（1）C-端氨基酸锚定于树脂载体，（2）脱去N-端保护基团，（3）与下一个氨基酸残基交联。重复第2步和第3步操作。最后，第4步从树脂释放合成多肽。 图图3.40 MALDI-TOF质谱。质谱。（1）与适当介质混合的蛋白质，用激光束离子化。（2）电场加速使离子穿过飞行管到达探测器。（3）最轻的离子最先到达。（4）离子化激光束同时启动离子飞行时间(TOF)计时器。图图3.41 胰岛素和胰岛素和b-b-乳球蛋白的乳球蛋白的MALDI-TOF质谱。质谱。胰岛素（I）和b-乳球蛋白（L）各5 pmole，用MALDI离子化，产生的主峰是单质子峰(I + H)+或（L+H)+、还有少量的胰岛素

25、二体（2I+ H)+峰。图图3.42 质谱进行蛋白组学分析。质谱进行蛋白组学分析。用trypsin处理酵母核孔复合物（来自凝胶电泳的条带），然后进行质谱分析。质谱图谱有很多峰与酵母基因组所编码的三种蛋白质（Nup120p, Kap122p,和Kap120p）的多肽片段吻合。该条带的表观分子量是100kD。图图3.43 3.43 x-光晶体衍射光晶体衍射实验实验。x-线源产生一束x-光，后者为晶体衍射。检测器收集衍射图谱。图图3.44 3.44 x-射线衍射图谱。射线衍射图谱。肌球蛋白晶体的x-射线衍射图谱截面。图图3.45 3.45 肌球蛋白电子密度图截面肌球蛋白电子密度图截面。该截面的电子密度图显示血红素。中心区域是铁原子。图图3.46 美国地理图谱。美国地理图谱。Colora