自选模块选修生物技术实践

1、第一讲微生物的利用知识点一微生物的培养和分离1培养基的成分和分类(1) 微生物的营养：碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。(2) 培养基的类型：按物理性质分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基。按目的用途分：鉴别培养基、选择培养基。2灭菌操作(1)无菌操作的概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。主要包括：各种器皿必须无菌；培养基也必须要无菌；转移菌种时不能带入其他杂菌。(2)消毒和灭菌的区别：条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死

2、物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌3.培养和纯化大肠杆菌(1)大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。(2)大肠杆菌培养：LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养；LB固体培养基分离纯化，鉴定菌种。(3)大肠杆菌的培养和分离实验步骤：配制培养基(称量、溶化、调pH)灭菌制作平板扩大培养划线分离菌种保存。(4)分离方法：划线分离法(方法简单)和涂布分离法(单菌落更易分开，但操作复杂)。知识点二分离以尿素为氮源的微生物1实验目的(1)使用专一的培养基(含尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。(2)使用指示剂(酚红)颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。2实验原

3、理由于有些细菌能产生脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色。(NH2)2COH2O2NH3CO23实验步骤制备平板制备细菌悬液涂布分离法分离细菌倒置培养观察计数。4实验结果(1)与稀释度为105相比，培养基中的平均菌落数在104处理中多。(2)在相同稀释度的情况下，尿素培养基中的平均菌落数少于LB培养基中的平均菌落数，其原因是大多数微生物不能利用尿素为氮源。(3)在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带。 考点一|培养基及微生物的纯化培养技术1培养基营养要素基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特

4、殊营养物质以及氧气的需求。营养要素来源功能碳源无机碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物构成细胞中的物质和一些代谢产物；既是碳源又是能源有机碳源糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等氮源无机氮源无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等将无机氮合成含氮的代谢产物有机氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶和核酸的组成成分；参与代谢过程中的酶促反应特别提醒(1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。(3)有些培养基不需

5、要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。2微生物的纯化培养方法划线分离法涂布分离法注意事项(1)接种环的灼烧：第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破(1)稀释操作时：每支试管及其中的水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处(2)涂布平板时：涂布器用体积分数为7

6、0%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体典例1右图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是()A在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌B划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上C接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的D第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数解析在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内

7、，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。答案C1消毒和灭菌的辨析项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物煮沸消毒法日常用品紫外线消毒法接种室、超净台化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌过滤灭菌不能加热灭菌的化合物，要用G6玻璃砂漏斗过滤2大肠杆菌的培养和分离应注意的几个问题(1)在倒平板过程中，不能将培养基溅在皿壁与皿

8、盖上，防止杂菌污染。(2)本实验需设置空白培养基在相同条件下一起培养，以确定是否有杂菌污染。(3)培养皿倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基中难以形成单菌落。(4)实验操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。针对练习1细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次

9、用于杀灭哪些部位的杂菌()A接种环、手、培养基B高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环 D接种环、手、高压锅解析：选C一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手臂需要消毒处理。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。2(2014·全国卷)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题

10、：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过_灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_。(3)示意图A和B中，_表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行

11、振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高_的利用率。解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数38×10×100×1 0003.8×107(个)。(2)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落

12、。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格3.8×107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)B(4)溶解氧营养物质考点二|分离以尿素为氮源的微生物1实验步骤(1)制平板：在酒精灯火焰旁将LB固体培养基和尿素固体培养基(选择培养基)分别倒在两个培养皿中，在超净台上摇匀，平放至凝固。(2)制备细菌悬液：将1 g土样依次稀释出10

13、2、103、104和105土壤稀释液，备用。(3)用涂布分离法分离细菌：取0.1 mL稀释104和105土壤稀释液，分别加到LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再用刮刀将菌液涂布到整个平面上。(4)培养：将培养皿倒置，在37 恒温培养2448 h。(5)观察培养基中的菌落数。2实验结果(1)与稀释度为105相比，LB培养基中的菌落数在104处理中多，尿素培养基中的菌落数在104处理中多；在相同稀释度的情况下，尿素培养基中的菌落数少于LB培养基中的菌落数，其原因是大多数微生物不能利用尿素为氮源。(2)在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带，理由是：细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素分解，产生氨，

14、氨为碱性，使培养基中的酚红变为红色。典例2 (2014·学军中学月考)尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：K2HPO4NaClH2O葡萄糖尿素酚红琼脂0.12 g0.12 g15 mL0.025 g2.0 g0.25 mg0.5 g(1)分解尿素的细菌在生态系统中属于_(成分)，该种细菌在生态平衡中的作用是_，写出细菌分解尿素的方程式_。(2)根据培养基的成分推断，该同学能否分离出土壤中只分解尿素的细菌_(填“能”或“否”)，推断理由是_。(3)分

15、离得到分解尿素的细菌后，则应选择液体培养基进行_。培养一段时间后，要借助显微镜并使用_对微生物细胞进行计数。计数过程中，下列哪种行为会影响计数的准确性()A计数时直接从静置培养的试管底部取培养液进行计数B .如果方格内微生物细胞数量多于300 个，培养液先稀释后再计数C如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞D压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数 (4)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用_技术。解析土壤中能分解尿素的细菌能利用环境中的有机物，在生态系统中属于分解者，能参与N素循环。由于培养基中使用了琼脂，而琼脂

16、是混合物，含有氮素，所以生长的微生物中不只是以尿素为氮源的微生物。分离所得菌种经液体培养基可以扩大培养。使用血球计数板可以计数培养液中的菌体数，计数时混合均匀后取少量培养液进行计数，如果方格内微生物细胞数量多于300 个，培养液要先稀释后再计数，如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞，压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数。答案(1)分解者参与了氮循环(或维持氮平衡)(NH2)2COH2O2NH3CO2(分子式、符号、条件缺一不可)(2)不能琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物(3)扩大培养血细胞计数板A(4)固定化酶“分

17、离以尿素为氮源的微生物”实验时注意的几个问题(1)用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基的原因：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂。(2)有脲酶的细菌菌落周围出现红色环带的原因：细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里为黄色，在碱性环境里变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小

18、代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(3)灭菌：配置尿素固体培养基后加封口膜用高压蒸汽灭菌法灭菌，冷却到60 ，加入G6玻璃漏斗过滤的尿素溶液，摇匀，待用。尿素加热会分解，所以要灭菌后再加入。针对练习3(2012·浙江高考)幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答：(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有_，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现_色环带。(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。A高压蒸汽B紫外灯照射C

19、70%酒精浸泡 D过滤(3)步骤X表示_。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液_到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得_菌落。(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在_中。若不倒置培养，将导致_。(5)临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的_分解为NH3和14CO2。解析：(1)脲酶能特异性地催化尿素水解释放出NH3和CO2。所以加入尿素作为氮源，加入酚红指示剂(高pH时呈现红色)能指示以尿素为氮源的细菌的存在。(2)由于尿素在高温下会分解，因此对尿素溶液的灭菌要采用玻璃漏斗过滤的方法。(3)本题运用的是涂布分离法，该方法能更容易获得单菌落，但操作较

20、复杂。(4)在倒平板和培养过程中，会产生水蒸气，如果正置，那么水蒸气在皿盖上凝结成水珠后会滴在培养基上，会污染细菌，导致不能分离出单菌落。(5)该题中Hp含有脲酶，能把尿素分解成NH3和CO2。患者通过服用被14C标记的尿素并检测呼气中的被14C标记的CO2的含量来判断人体是否感染Hp。答案：(1)脲酶红(2)D(3)接种涂布单(4)恒温培养箱无法形成单菌落(5)尿素课堂对点练题组一微生物的分离与培养操作1(2013·江苏高考)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是()A培养基分装到培养皿后进行灭菌B转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线C接种后的培养皿须放在光

21、照培养箱中培养D培养过程中每隔一周观察一次解析：选B培养微生物过程中应先灭菌再倒平板；每一次划线前都要进行接种环的灼烧灭菌；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，光照会影响温度等条件；培养过程中观察间隔的时间一般不超过24 h。题组二微生物的培养和纯化2(2014·四川高考)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如下图甲、乙所示。(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、_四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是_。(2)与微生物培养基相比，植物组织培养的

22、培养基常需添加生长素和_，这些植物激素一般需要事先单独配制成_保存备用。(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是_。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_。(4)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是_，该实验设计是否合理？为什么？_。解析：(1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要分离出有降解苯磺隆能力的土壤中的某些微生

23、物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)与微生物培养基相比，植物细胞培养的培养基需要添加生长素和细胞分裂素，用于调节植物细胞再分化；这些植物激素一般需要事先单独配制成母液保存备用。(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。划线的平板培养后，发现第一划线区域的划线上不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，而其他划线上有菌落。造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域第一条线时未从第一区域末端开始。(4)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降

24、解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件同图乙的空白对照。答案：(1)氮源和无机盐只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖(2)细胞分裂素母液(3)接种环接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始(4)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质不合理，缺少空白对照课下提能练1除了高温加热以外，其他灭菌方法还有()A长时间紫外线照射B真空包装C用保鲜膜密闭 D添加防腐剂解析：选A灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。真空包装、添加防腐剂、用保鲜膜密闭都起到了抑菌作用，紫外线照射使细菌的蛋白质变性，核酸受破坏，是灭菌方法。2下列关于微生物分离和培养的叙

25、述，错误的是()A微生物培养前，需对培养基进行消毒B测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法C分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度D分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源解析：选A微生物培养前，要对培养基进行灭菌；菌落计数法可以测定土壤样品中的细菌数目；不同微生物在土壤中含量不同，故分离不同微生物需采用不同的稀释度；在以尿素作为唯一氮源的培养基上，只有能分解尿素的细菌可以生长。3(2015·镇海中学月考)检验饮用水的细菌含量是有效监控疾病发生的必要措施。请回答下列与检验饮用水有关的问题：(1)要测定饮用水中大肠杆菌的数量，常采用_法，通常将水样进行一系列的梯度_，

26、然后将上述的水样用涂布器分别涂布到_的表面进行培养，记录菌落数量。用该方法统计样本菌落数时_(填“是”或“否”)需要对照组。原因_。(2)下图所示的四种菌落分布图中，不可能由上述方法得到的是_。 (3)大肠杆菌培养的条件需无菌，培养基配制时需加入氯化钠，以维持_。配制培养基时先_(填“调节pH”或“灭菌”)后_(填“调节pH”或“灭菌”)。解析：测定饮用水中细菌数目可以采用涂布分离法，涂布前需先稀释样品以获得合适的计数平板，稀释后的水样涂布于LB固体培养基上，培养时需同时培养一个未接种的空白培养基作为对照，从而判断培养基是否已被污染。题图中D是经划线分离后培养所得结果。LB培养基中加入NaCl

27、除作为无机盐外，还能维持培养基的渗透压。培养基配制后先调pH值后灭菌才能使用，若先灭菌后调pH值就不能保证调pH值后的培养基无菌。答案：(1)涂布分离稀释LB固体培养基是因为需要判断培养基使用之前是否被杂菌污染(培养基灭菌是否合格)(2)D(3)渗透压调节pH灭菌4(2013·全国卷)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用_法或_法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。(2)取该单菌落适当稀释，用_法接种于

28、固体培养基表面，在37 培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明_；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的_。(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素_。解析：(1)微生物的常用接种方法为划线法和稀释涂布法。(2)能够使菌落均

29、匀生长、布满平板的接种方法为涂布法。(3)含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A敏感；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B不敏感；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；含D的滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落(排除杂菌污染)，说明该致病菌可能对抗生素D产生了抗药性。答案：(1)划线稀释涂布(或涂布)(2)涂布(3)敏感不敏感该致病菌对C的敏感性比对A的弱耐药菌(4)A5自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题

30、：实验步骤：(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。(2)为了得到更加准确的结果，你选用_法接种样品。(3)适宜温度下培养。结果分析：(1)测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是_，其理由_。A一个平板，统计的菌落数是230B两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260D四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250(2)一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落

31、数是_(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)。(3)用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测得的数量_，因为_。解析：为了得到更加准确的结果，应用稀释涂布平板法接种样品。选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。234÷0.1×1052.34×108。因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。答案：实验步骤：(2)稀释涂布平板结果分析：(1)D在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否相当(2)2.34×108(3)

32、多当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落6(2015·湖州中学周考)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。 (1)号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入_作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，因以_作为唯一碳源。(2)配置固体培养基的基本步骤是()A计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D计算、称量、灭菌、溶化、倒平板(3)溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为_。(4)过程是_

33、，过程所使用的接种方法是_法。(5)部分嗜热菌在号培养基上生长时可释放_分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行_培养。解析：固体培养基通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得产生高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。配置固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。配置培养基时加热溶化中，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底和溢出。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌。仔细观察题图可知，过程是菌液稀释，过程是采用涂布法接种的。能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落

34、再分离纯化可获得相应菌种，以后可以扩大培养用于生产。答案：(1)琼脂淀粉(2)C(3)搅拌高压蒸气灭菌(4)稀释涂布分离(5)淀粉酶扩大第二讲酶的应用知识点一果汁中的果胶和果胶酶1果胶及其特性果胶是植物细胞壁的主要成分，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。果胶起着粘合细胞的作用，去掉果胶植物组织将变得松散。果胶不溶于乙醇中，这是鉴别果胶的一种简易的方法。2果胶酶的组成及作用通常所说的果胶酶包括果胶酶和果胶甲酯酶，能使果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯，瓦解植物细胞壁和胞间层。3实验步骤第一步制匀浆第二步烧杯A烧杯B5 g匀浆5 g匀浆10 mL黑曲霉提取液10 mL水间歇搅拌2030

35、min第三步试管1试管2试管3试管4A烧杯混合物4 mLA烧杯混合物4 mLB烧杯混合物4 mLB烧杯混合物4 mL沸水浴不加热沸水浴不加热上清液最澄清澄清较浑浊浑浊第四步加入95%酒精4 mL沉淀物最少沉淀物较少沉淀物最多沉淀物较多4实验结论果胶酶能分解果胶，提高果汁的澄清度。知识点二­淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测(1)固定化酶的含义：是指将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂的方法。(2)固定化的方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。(3)固定化酶的优点：稳定性提高；易分离；可反复利用。(4)­淀粉酶的固定化及淀粉

36、水解作用的检测：淀粉的水解过程：淀粉糊精麦芽糖葡萄糖(遇碘显蓝色) (遇碘显红色) (遇碘不显色)­淀粉酶的固定化(如右图)。5 mg ­淀粉酶溶于4 mL蒸馏水，加入5 mg石英砂，搅拌30 min。将石英砂装入含气门芯并用夹子封住的注射器中。用40 mL蒸馏水用流速1 mL/min来洗涤除去未吸附的游离淀粉酶。使淀粉溶液以0.3_mL/min的流速过柱，在流出5 mL后接收0.5 mL流出液。加入12滴KI­I2溶液，观察颜色变化。实验预期结果： 水解产物糊精遇碘呈红色。 考点一|果汁中的果胶和果胶酶探究影响果胶酶活性因素实验的分析(1)实验原则：单一变量原则

37、、对照性原则。严格控制变量，尽量减少无关变量的影响。(2)实验原理：果胶酶活性受温度、pH或酶抑制剂的影响，在最适温度或pH时，活性最高，果肉的出汁率、果汁的澄清度都与果胶酶的活性大小成正比。(3)设计实验：探究最适温度时，pH为无关变量，最好是最适pH；探究最适pH时，温度为无关变量，最好是最适温度。探究果胶酶的最适用量时，最适用量是在温度、pH等适宜条件下测出来的，如果无关变量改变，最适用量也会发生变化。典例1下列有关果胶酶及果胶酶实验探究的叙述正确的是()A探究果胶酶的最适用量时，pH、温度不影响实验结果B果胶酶包括果胶酶、果胶甲脂酶和葡萄糖异构酶等C探究温度对果胶酶活性影响时，温度、苹

38、果泥、果胶酶用量及反应时间等都是自变量D可以用相同时间内过滤得到的果汁体积来确定果胶酶的最适用量解析探究果胶酶的最适用量时，pH、温度会影响实验结果；葡萄糖异构酶不属于果胶酶；探究温度对果胶酶活性影响的实验中，温度为单一变量，其他因素保持不变；可以用相同时间内过滤得到的果汁体积和通过比较果汁的澄清度来确定果胶酶的最适用量。答案D1果胶是细胞间的黏连成分，也是果汁中的成分，加入果胶酶可将细胞离析，增加固形物的分散度。此外，还降低了水果匀浆悬液的黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。2品质最好的果汁应该是：尽量保留水果中的营养成分。具有水果的原始口味。有更多的固形物。分散程度好，不沉

39、淀，不上浮。有原始的水果色彩。除去所有的机械组织，更易消化。因此，能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中的条件就是最佳条件，达到这些条件的方法要温和，且对人体无害。针对练习1工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高水果的出汁率，为研究温度对果胶酶活性的影响，某同学设计了如下实验：将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在10 水浴中恒温处理10分钟(如图甲所示)。：将步骤处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10 水浴中恒温处理10分钟(如图乙所示)。：将步骤处理后的混合物过滤，收集滤液，测量果汁量(如图中丙所示)。：在不同温度条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，结果如下表：温度/1020304

40、050607080果汁量/mL813152515121110根据上述实验，请分析回答下列问题：(1)果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以分解细胞壁中的果胶，产物是_。(2)为什么该实验能够通过测定滤出的苹果汁量的大小来判断果胶酶活性的高低？_。(3)下图中A、B、C图依次表示果胶酶浓度一定时，果胶酶的反应速度与反应物浓度、温度、pH之间的关系，据图完成下列问题：图A中，反应物达到某一浓度时反应速度不再上升的原因是_。图B中，曲线ab段表明_， 曲线bc段表明_。将装有果胶酶与反应物的甲、乙两支试管分别放入12 和90 水浴锅中，20分钟后取出转入40 的水浴锅中保温，两支试管内的反应是：甲_，

41、乙_。图C表示果胶酶浓度、反应物浓度、温度等一定时，果胶酶催化反应的速率随pH变化的曲线，实验时可根据_来判定果胶酶的最适pH。解析：(1)果胶酶催化植物细胞壁中的果胶分解成为半乳糖醛酸。(2)该实验中衡量结果的指标有两项，一是观察在相同的时间内，滤出苹果汁的量的多少，量多说明果胶酶活性高，将果胶分解得多，使果汁更好地流出；二是观察果汁的澄清度。(3)酶是生物体内具有催化能力的有机物，绝大多数是蛋白质，其催化效率受反应物浓度、温度、pH的影响。图A中，当反应物在低浓度范围内增加时，反应速度迅速上升；当反应物达到一定浓度时，随反应物浓度增加， 反应速度不再增加。这是因为酶虽然有高效性，但催化能力

42、也有一定限度，当所有酶都发挥了最高效能后，反应物浓度再增加，反应速度也不增加，这时受酶浓度影响。从a点到b点曲线上升，这是因为温度升高，酶活性升高。曲线bc下降，因为温度超过最适温度，酶活性降低。由于甲试管温度较低，所以酶活性较低，反应速度很慢，当转入40 (酶反应的适宜温度)的水浴锅中加热时，其反应速度迅速增加。乙试管在90 高温下，酶结构被破坏，酶变性失活，当转入40 的水浴锅中保温时，酶活性也不再恢复，故无催化反应。图C表示果胶酶浓度、反应物浓度、温度等一定时，果胶酶催化反应的速率随pH变化的曲线，实验时可根据果汁的量来判定果胶酶的最适pH。答案：(1)半乳糖醛酸(2)果胶酶将果胶分解为

43、小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁量的大小反映了果胶酶催化果胶分解的能力(3)受反应物中酶浓度的限制果胶酶的活性随温度升高而升高果胶酶的活性随温度的继续升高而下降反应速度加快无催化反应果汁的量考点二|­淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测直接使用酶、固定化酶的比较比较项目直接使用酶固定化酶酶的种数一种或几种一种常用载体高岭土、皂土、硅胶、凝胶制作方法化学结合固定化、物理吸附固定化是否需要营养物质否否催化反应单一或多种单一反应底物各种物质(大分子、小分子)各种物质(大分子、小分子)缺点对环境条件非常敏感，易失活；难回收，成本高，影响产品质量不利于催化一系列的酶促反应优点催化效

44、率高、耗能低、低污染既能与反应物接触，又能与产物分离；可以反复利用典例2试分析下图中，与石英砂载体制备固定化­淀粉酶相似的是()解析A是吸附法；B是化学结合法；C和D是包埋法，C一般是将酶包埋在细微网格里，D是将酶包埋在凝胶中。石英砂可以吸附酶分子，所以与A相似。答案A1­淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测(1)原理：用吸附法将­淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。(2)淀粉水解作用的检测：原理：淀粉遇碘显蓝色，糊精遇碘显红色，麦芽糖遇碘不显色，本实验使用的是枯草杆

45、菌的­淀粉酶，其作用的最适pH为5.57.5，最适温度为5075 。水解过程如下：2证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀粉酶的方法可在试管中加入1 mL可溶性淀粉溶液，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管增加温度，几分钟后加12滴KI­I2指示剂，如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。用固定在石英砂上的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，才能表明是淀粉酶的固相酶作用的结果。针对练习2(2015·富阳3月周考)下列是有关固定化酶及细菌培养与分离的问题。请回答：(1)固定化酶是将水溶性的酶用物理或_的方法固定在某种介质上，使之成为 _ 而又有酶活性的制

46、剂。可用 _ 法将­淀粉酶固定在石英砂上形成固定化酶柱。(2)为获取土壤中的芽孢杆菌，某同学进行了相关实验，操作流程如下：上图中步骤A为_，步骤B为_。要判断培养基灭菌是否彻底，可采用的方法是_。(3)下列消毒灭菌方法中，常用于接种环灭菌的是_。A70%酒精浸泡B紫外线照射 C灼烧 D高压蒸汽(4)请分析划线分离法能得到单菌落的原因：_。答案：(1)化学不溶于水吸附(2)制平板培养将灭菌后的培养基培养一段时间后观察是否出现菌落(3)C(4)划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，到划线最后部分细菌间距离加大，经培养后能得到单菌落课堂对点练题组一果胶酶的应用1用果胶酶处理苹果泥时为了使果胶酶

47、能够充分地催化反应，应采取的措施是()A加大苹果泥用量 B大幅度提高反应温度C换成大型号容器 D用玻璃棒进行搅拌解析：选D为了使果胶酶能够充分地催化反应，应采取的措施是增大酶和反应物的接触面积，搅拌可以达到此目的。只换大型号容器不一定能加快反应。大幅度提高温度有可能会出现温度过高而使酶活性降低的现象。如果反应物已足够多，那么增加反应物也不能改变反应速率。题组二固定化酶2下列关于固定化酶的说法，错误的是()A固定化酶不足之处是不能催化一系列反应B固定化酶可再次利用降低了生产成本C固定后的酶既能与反应物接触，又能与反应物分离D固定化酶易溶于水解析：选D酶的固定方式有包埋法、化学结合法和物理吸附法，

48、酶经固定化后作为制剂使用有许多优点，如既能与反应物接触，又能与产物分离；不溶于水可以反复利用；稳定性提高。固定化酶的缺点是不利于催化一系列的酶促反应。课下提能练1下列关于果胶酶作用的叙述，错误的是()A分解水果细胞壁中的果胶，从而瓦解细胞壁B可将果胶分解成半乳糖醛酸，使果汁变清C分解水果细胞壁中的纤维素和果胶D可使果汁榨取变得容易，提高出汁率解析：选C果胶酶可将果胶分解为半乳糖醛酸，从而使果汁榨取的时候比较容易，并使果汁变清。要分解纤维素，需要纤维素酶。2酶的固定化是将酶束缚或限制于一定区域内，使其进行酶促反应后可回收及重复利用的一类技术，下列关于固定化酶技术的叙述不正确的是()A为使葡萄糖液

49、与葡萄糖异构酶充分接触生产果糖，葡萄糖液应从固定化酶反应柱下端注入B制备固定化酶的方法主要有化学结合法和物理吸附法C固定化酶固定时可能会对酶造成损伤而影响其活性D用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆可以大幅度提高产量解析：选A葡萄糖液应从固定化酶反应柱的上端注入，使葡萄糖液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖。制备固定化酶的方法主要有化学结合法和物理吸附法。固定化酶固定时可能会对酶造成损伤而影响其活性。3某校生物兴趣小组为探究不同浓度果胶酶对苹果匀浆出汁率的影响，进行了如下实验。实验步骤：制备苹果匀浆。将苹果洗净，切成小块，用榨汁机打碎成苹果匀浆。加热苹果匀浆到100 ，再冷却至50

50、左右。配制不同浓度的酶液。取5支10 mL的试管，依次编号为26号。分别加入不同量的质量浓度为10 g/L的果胶酶溶液，再分别加入苹果酸定容至10 mL，获得质量浓度分别为2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的果胶酶溶液，备用。降解苹果匀浆(如下图所示)。沉淀。向上述6只烧杯中添加明胶、活性炭等物质搅拌处理，充分混匀后静置，分别过滤。记录并处理结果：用量筒测量澄清滤液(即苹果汁)的体积，记入表格，并计算出汁率。请回答下列问题：(1)果胶酶能提高苹果的出汁率并使果汁澄清的原理是_。(2)步骤中，将苹果匀浆加热到100 的目的是_。(3)步骤中，在26号试管中加入10 g/L果胶酶溶液的量分别是_；步骤中，在1号烧杯中加入1 mL_。(4)根据预期结果，请在右图中绘制出苹果匀浆出汁率与果胶酶浓度之间大致的关系曲线，并在坐标轴上标出苹果匀浆最高出汁率所对应的果胶酶最佳浓度。解析：果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一。在果汁加工中，果胶不仅影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能分解果胶，瓦解植物细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得容易，也使浑浊的果汁变得澄清。在研究酶浓