核酸大分子结构鉴定

1、核酸大分子结构鉴定概论912102380123 秦雷廷摘要：本文综述了关于核酸大分子的相关信息，包括概念，结构，作用以及其结构的鉴定方法。同时也引用了已经发表的论文里面的部分内容，对论述进行了补充与完善，并对结构鉴定的相关方法进行了简述与评价。对于未来核酸大分子方面的研究进行了憧憬与设想。关键词：核酸大分子结构鉴定DNARNAAbstract: This article reviews the related information of the nucleic acid molecules, including the concept, structure, function and the

2、 identification method of the structure. At the same time, it also refers to the contents of the papers published in the paper, the discussion is supplemented and improved, and the structure of the relevant methods of identification and evaluation. For the future research of nucleic acids in the fut

3、ure, the vision and imagination.Key words: nucleic acid molecular structure identification DNARNA引言：核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用其中转运核糖核酸，简称tRNA，起着携带

4、和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。核酸同蛋白质一样，也是生物大分子。核酸的相对分子质量很大，一般是几十万至几百万。核酸水解后得到许多核苷酸，实验证明，核苷酸是组成核酸的基本单位，即组成核酸分子的单体。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。核酸核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也

5、占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸在实践应用方面有极重要的作用，现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。如人类镰刀形红血细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酪氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA，从而有可能创造出新型的生物品种。如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌产生胰岛素、干扰素等珍贵的生化药物。核酸的发现:1869年，F.Miescher从脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸

6、性化合物，因存在于细胞核中而将它命名为“核质”(nuclein）。但核酸(nucleicacids）这一名词在Miescher发现“核质”20年后才被正式启用，当时已能提取不含蛋白质的核酸制品。早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能这样的重要问题。DNA遗传物质:1944年，Avery等为了寻找导致细菌转化的原因，他们发现从S型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化为S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不发生。结论是：S型菌的DNA将其遗传特性传给了R型菌，DNA就是遗传物质。从此核酸是遗传

7、物质的重要地位才被确立，人们把对遗传物质的注意力从蛋白质移到了核酸上。双螺旋结构:核酸研究中划时代的工作是Watson和Crick于1953年创立的DNA双螺旋结构模型。模型的提出建立在对DNA下列三方面认识的基础上：1核酸化学研究中所获得的DNA化学组成及结构单元的知识，特别是Chargaff于1950-1953年发现的DNA化学组成的新事实；DNA中四种碱基的比例关系为A/T=G/C=1。2X线衍射技术对DNA结晶的研究中所获得的一些原子结构的最新参数。3遗传学研究所积累的有关遗传信息的生物学属性的知识。综合这三方面的知识所创立的DNA双螺旋结构模型，不仅阐明了DNA分子的结构特征，而且提

8、出了DNA作为执行生物遗传功能的分子，从亲代到子代的DNA复制(replication）过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性。其正确性于1958年被Meselson和Stahl的著名实验所证实。DNA双螺旋结构模型的确立为遗传学进入分子水平奠定了基础，是现代分子生物学的里程碑。从此核酸研究受到了前所未有的重视。DNA分子具有规则的双螺旋结构。是由两条相互平行且反向右旋的脱氧核苷酸长链所构成，分子中央的碱基碱基互补配对原则以氢键相连。DNA独特的双螺旋结构和碱基互补配对能力使DNA的两条链“可分”，“可合”，半保留复制自如，“精确”复制的DNA通过细胞分裂等方式传递下去，使子代（或体细胞）含有

9、与亲代相似的遗传物质。但“精确”复制并不是绝对不存在差错，复制差错率非常低（约110亿分之一），然而却导致基因发生突变，出现新基因，产生可遗传的变异，有利于生物的进化。正文：X射线衍射成：DNA的最初结构是由X射线照射后成像发现的。1952年前后，富兰克林已经通过实验证明，DNA根据水分含量的差别分为A型和B型两种形式的存在。他在不断地完善DNA的X射线衍射图谱，并独自进行数学分析，她始终不敢相信DNA在任何情况下都会呈螺旋形，而是将其视为在特殊条件下出现的一种特殊情形。未来诺贝尔奖获得者沃森一直在助手协助下，悄悄地重复着富兰克林的某些X射线工作。他同时还给沃森看了一些新的X射线照片，其中包括

10、由富兰克林拍摄、一直秘而不宣的一张DNA之B型X射线衍射照片。看到后一张照片时，沃森“惊得下巴差点掉了下来”，“心跳也加快了”。这是一张具有里程碑意义的图像，因为它已经很清楚地显示出一种双螺旋结构。威尔金斯此举，富兰克林毫不知情，后人评价：“如果这不是一次无私的为了科学进步而分享信息的举动，那也应该算是一次愤怒的报复行为。”开悟”了的沃森与克里克随即展开新一轮建模工作。1953年2月28日，克里克冲进剑桥大学校园内他们常去的那个老鹰酒吧，大声向酒客们宣布：他和沃森“已经发现了生命的秘密”！将近两个月后的4月25日，他们撰写的千字论文发表在自然杂志上，引起轰动。从那以后，包括遗传密码的揭示和人类

11、基因组计划等在内的各种生物学上突破接踵而至，一个新的时代开始了！基于小分子核苷酸结构探索：DNA双螺旋结构的稳定性主要来源于碱基对之间的堆积作用力.核酸作为生命体系遗传物质的重要性,使其成为药物的关键作用靶点.核酸的一个重要的特征是结构多态性,即特定的核酸序列具有多样的构象和结构,而小分子天然具有多种多样的立体结构,这就需要科学家们努力寻找靶向特定结构核酸的小分子.平行堆积的碱基、糖环聚合连成的阴离子磷酸骨架以及核苷酸链之的沟区组成了小分子的识别位点.仪器的发展为研究小分子与核酸的相互作用提供了基础.光谱法主要包括圆二色光谱、紫外可见吸收光谱、荧光光谱、红外光谱、拉曼光谱;其他重要的包括凝胶电

12、泳、亲和色谱法、质谱、电化学方法、微量热以及粘度法;原子力显微镜(AFM)、扫描隧道显微镜(STM)、X射线晶体衍射和核磁共振技术等作为新兴的研究工具,也被用于小分子与核酸的相互作用研究中.由于小分子与核酸相互作用的复杂性,通常需要多种研究手段结合起来揭示他们的作用本质.相比不同形式的双链DNA结构,与单链DNA相关所形成的二级结构数目更多,已经得到广泛研究的有G四链体、C-四链体、三链核酸、环状结构及突起结构等.尽管其中一些结构在生命体系中的重要性并没有得到完全的展示,但是当生命处于DNA复制、转录、核酸修复或者重组中时,科学家们已经探测到了很多脱离双链而以单链形式存在的核酸,因此单链DNA

13、及其与蛋白或小分子的复合物具有不同的生物活性,而化学家可以直接应用小分子介入这一重要生命过程,有效地调控生命体系.这也是化学生物学新兴的一个重要方向.通过小分子和核苷酸的识别，可以进行核苷酸结构的鉴定。（1）小分子与四链核酸的相互作用。1962年,美国科学家Davies通过X射线晶体衍射发现,富含鸟嘌呤的DNA分子在一定条件下可以通过共平面的四个鸟嘌呤之间的胡斯坦(hoogsteen)氢键作用形成G-四分体平面,而通过磷酸-核糖骨架连接,两个或多个G-四分体平面之间能相互堆积,形成更高级的四螺旋结构,即为G四链体结构(图1).随后,人们在体外探测到了多种多样的G四链体结构,研究结果表明,染色体

14、末端-端粒区域富含G序列.1991年,研究发现体外折叠成G-四链体的端粒DNA不能被端粒酶延伸,因而具有稳定G-四链体能力的小分子研究逐渐成为热点.之后新的发现表明,富含G的序列在很多基因的启动子区广泛存在,因此G-四链体可以作为调控基因表达的开关,直接影响细胞的表型.十几年来,科学家们已经报道了大量天然的或人工合成的小分子G-四链体稳定剂,很多具有较好的靶向选择性(靶向G-四链体而非双链DNA).近些年来,科学家逐渐将筛选新型G-四链体稳定剂的目光投向了过渡金属配合物,这主要是由于过渡金属离子与多样的芳香性配体能够形成多种多样的结构,并且整体可以和G-四链体的末端平面产生相互堆积作用;另一方

15、面,G-四链体的负电磷酸骨架本身能够和金属配合物的正电相互吸引,从而增强他们的结合能力.（2）小分子与左旋脱氧核糖核酸结构的识别：左旋脱氧核糖核酸中没有大沟区,只有一个狭而深的螺旋沟,每一圈具有12个碱基对.很长一段时间里,人们只在体外探测到左旋脱氧核糖核酸的存在,后来的证据表明,细胞内存在一些左旋脱氧核糖核酸的稳定因素,左旋脱氧核糖核酸可以调控细胞基因的表达.DNA的一些表观遗传修饰也可以促进左旋脱氧核糖核酸的存在,当胞嘧啶C5发生甲基化时,甲基的疏水性可以促进B-DNA转变为左旋脱氧核糖核酸.而胞嘧啶C5位甲基化在真核细胞中普遍存在,而在很多基因的启动子区域富含CG序列,也容易在一些调控因

16、素的作用下形成左旋脱氧核糖核酸.尽管热力学不倾向于形成左旋脱氧核糖核酸,但当DNA发生解链时,左旋脱氧核糖核酸等局部不稳定位点可以在DNA复制和转录中有效参与基因的调节.而调控蛋白通常通过识别作用于DNA的大沟区参与基因表达的调控,当B-DNA转变成左旋脱氧核糖核酸时,大沟区消失,原先的调控蛋白对DNA信息的识别发生很大变化,新的调控蛋白加入进来.这些结果都显示,人们可以通过外加的小分子配体,促成左旋脱氧核糖核酸的形成并改变生命体系中相关蛋白质的识别方式,从而有效达到调控相关基因表达的目的.（3）小分子与三股螺旋DNA的相互作用：人端粒DNA序列中三组串联的鸟嘌呤重复序列可以在Na+的缓冲溶液

17、或者K+缓冲溶液中形成三股螺旋的结构,这是一个非常有趣的结果,相关功能的研究正在进行中.通过光镊技术、MD模拟以及圆二色谱技术研,结果表明端粒区的三螺旋DNA是热力学和动力学稳定的.因此三链DNA可以作为一种潜在的识别手段用于对DNA特定序列的探测和干扰细胞重要生命过程的研究,小分子针对三螺旋DNA的研究发展很快,代表了一种直观有效的策略.FPLC分离鉴定寡脱氧核苷酸片段：反义核酸药物通过与特定的互补序列结合，干扰复制和转录，能够选择性地关闭基因，因此已成为一种极有价值的工具，能被广泛地用来治疗病毒性疾病、癌症、寄生虫和遗传性疾病。通常它是寡核苷酸片段，一般在20个核苷酸左右，多采用大规模机器

18、合成因此需要有效的检测手段来鉴定产物的纯度。目前用于鉴定的方法主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、薄层层析(TLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、高技液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(cE)等。其中PAGE、TLC使用较为麻烦，耗时较长；用于CE的凝胶柱价格高，寿命短；HPLC容易导致生物分子失活；而FPLC因其快速、不失活的特性最适于用作生物分子的分离鉴定。同时，核酸产物的鉴定常需多种手段配合进行。Fl，LC一般用于蛋白质的分离，较少用于核酸的分离，只有WestmanE、PodellS等人在限制性酶切片段以及标记DNA探针方面使用FPLC作过一些研究_l,23。本文中我们用阴离子交换柱

19、MONOQ分离鉴定由机器合成的1525个碱基范围的寡核苷酸片段，在适当条件下，19、20和21个碱基的3种寡核苷酸片段能很好地分开。核磁共振技术测定溶液中DNA结构：用核磁共振方法确定 DN A的结构一般可分为两步: 首先 ,归属分子中质子的共振峰 ; 其次 ,估测这些质子间相互作用的强度或它们之间的距离 .在结构测定中 ,有两类很重要的磁性核间相互作用: 间接的自旋 - 自旋偶合 (即 J 偶合 )和通过空间直接的偶极 - 偶极作用 .间隔三键的 J 偶合 ( 3J )与绕中间键旋转的扭曲角有关 ,故在结构测定中具有重要意义 .自旋间的偶极 - 偶极作用由于交叉弛豫而产生核的 Ov erha

20、user效应 ( Nuclear Ov erhauser Effect, NOE) ,它与相互作用的质子间距离的 6次方成反比 .DN A结构测定中两种基本的 2D NM R技术为: 化学位移相关谱 ( COSY) 5和二维 NO E实验 ( NO ESY).在 CO SY谱中 ,交叉峰出现在有 J 偶合的质子间 ,由峰的精细结构可得到 J偶合信息 .在 NOESY谱中 ,交叉峰出现在通过偶极 - 偶极相互作用而发生交叉弛豫的质子间 ,由峰强可得到质子间距离 .根据距离几何( Distance Geo metry, DG)等原理即可构筑 DN A在溶液中的三维结构 .核酸鉴定的应用：核酸结构和

21、序列的鉴定，对于生物领域，医学领域，化学领域等都有着重大的影响。生物领域，通过对不同生物细胞遗传物质的鉴定，可以发现其遗传方面的差异。医学领域，最为著名的就是DNA的鉴定，可以用于亲自鉴定，也是目前争议最大的方面。在法医领域，可以通过DNA进行罪犯的身份鉴定。化学领域，通过研究可以与核酸结构特异性结合的化合物，对核酸的遗传性状进行特定的改造。核酸的应用：1在医药方面的应用核酸是新一代的生物药物，具有遗传、催化，能量贮存，能量供给及增强免疫力等多种功能。利用核酸能进行新药的设计，在制造抗癌，抗病毒，治疗心肌梗塞及于扰素诱导剂方面具有广阔的前途。研究表明：核酸制品能延缓机体衰老过程并协调机体内部营

22、养平衡，对冠心病、脑血管病，糖尿病和肿瘤等疾病均有积极疗效。可以抑制癌细胞；用于癫痫；用于脑血管疾病；用于减肥，原因有二，1）摄取核酸使新陈代谢旺盛，细胞的分裂与功能旺盛。当新陈代谢时需要热量，就能够提高基础代谢量，当基础代谢量提高时，虽然吃的仍然不少，但消耗的热量更大，所以身体不会发胖。（2）核酸中所含的腺昔具有扩张血管的作用，同时还有抑制糖份分解酶的作用，会延迟糖分的吸收。因为吃甜食而过度发胖的人，会因此而减肥。用于治疗脱发；用于溶解胆结石；用于防止老化；用于性欲增强；用于预防肝病；用于治疗高血压和动脉硬化；用于糖尿病；用于改善贫血；用于美容皮肤。2在食品方面的应用食品工业是核酸的另一消费

23、大户，核酸经酶转化可得到5一肌着酸二钠（STMP）和5-鸟苷酸二钠（5GMP），二者均为无色至白色结晶或白色结晶性粉末。可分别用于午餐肉、火腿、咸肉等腌制肉类，最高允许用量一般为 500mgkg（以 5GMP计），也可按照我国GB276088规定，将二者用于混合味精，用量视正常生产需要，但其中味精含量不得低于80，其鲜味比一般味精高出40100倍，而且风味更好。目前世界上，如日本，美国等许多国家都在使用这种复合鲜味剂。据预测，今后10年将是这种鲜味剂发展的黄金时期。胞苷酸二钠和尿苷酸二钠也是核酸经酶转化得到的两种衍生物，其作用主要是补充牛乳中的核酸，以生产出接近人乳的母乳化牛奶，能增强婴儿的免

24、疫力，加入量为 0.0015%。3在农业方面的应用。核酸水解物腺苷酸可被用作植物的生物激素，是制造天然细胞分裂素，激动素，玉米素等腺嘌呤衍生物的原料，通过对水稻、苹果、小麦、大豆、油菜，首蓿、柑桔等多种作物进行对比试验，已取得不同的增产和早熟效果。此外核酸的衍生物也可作为防止植物病虫害的药物，并有望发展成为新一代无毒高效农药4在化妆品方面的应用由于核酸具有促进蛋白质合成的作用，核酸制品在化妆品行业的应用也很广泛，可添加于洗涤剂，乳化剂，雪花膏，乳液，戏剧化妆品中，能够促进皮肤的新陈代谢，具有防皱，生肌的作用，使皮肤变得光滑，对各种皮肤病均能起到较佳的治疗效果。其它在农牧渔业中，核酸可作为植物生长调节剂和饲料添加剂，在生化试验中可用作生化试剂核酸开发应用前景：据现在市场情况，由于我国对核酸下游制品的开发远远跟不上核酸产业的发展速度，目前核酸制品主要依靠进口，国产核酸不得不先出口国外，经国外企业加工成了最终商品后再返销回来，繁琐的中转程序使企业无法得到预期的经济效益。从长远看，国内的核酸市场非常广阔。首先，我国是