分析方法验证指引中文

1、分析方法验证指南1、目的本文件的目的是为分析方法验证的数据收集提供基本指南。该指南参考了 USP, EEC （BP/EP）和ICH中的分析方法验证指南，能够满足公司的产品的分析方法验证工作。2、范围本文件中提供的定义和程序是为了促使公司质量方针的基本原则符合所有关于方法验证的法规要求。本指南适用于API、原料、中间体的检测和放行的分析方法，并为新药物的应用收集支持性的数据。本指南是为了规范验证为公司的产品提供一个通用和分析方法验证方案。现有的方 法中的小变化不需要全面验证，如：对柱子的固定相的生产厂家变化，样品准备的变化（搅拌和 超声，震摇和超声）。在实际分析中，方法验证需要提供更多的信息或细

2、节，需要制定的特殊的方 案。这个指南不包括微生物分析方法的验证。3、参考文件USP<1225>，法定方法的验证ICH指南Q2A&Q2B，分析方法验证程序。公司关于有效数字修约原则4、定义降解物：降解物是由于一个物质经一段时间的化学变化（经过诸如光照、温度、pH、水分，经与 容器发生反应）产生，也叫降解产物或分解产物。大剂量原料药：原料药在产品中的最大剂量大于2g/天。定量限（LOQ）：指试样中的被分析物能够被定量测定的最低值，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。线性：在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被分析物的浓度直接呈线性关系的程度。通常相关系数（R）在回归线上有一

3、定的斜率（ m）。小剂量原料药：原料药的在产品中的最大剂量小于或等于2g/天。测量精密度（ICH-重复性）：多次测定同一样品时的重现性（RSD）。在HPLC或GC中也叫进样精密度。 方法精密度：同一样品或标准品（若有时）准备多份供试品在测定含量时的重现性（%RSD）。回收精密度：测定同一标准时对准确度和线性的评估。也叫水平精密度。报告限度（RL ）:低于某一数值的时候报告中就不体现。报告限度一般大于或等于定量限。再现性（ICH-中间精密度）：在不同检测条件下对样品检测结果的重现性。（不同的实验室、分析 人员、仪器、试剂、分析时间、日期等）5、指南A、总则 因为在对产品的物理性质的评估时，分析方

4、法会因测定的准确性和精密性而 有所不同，故验证的 可接受标准也不同于一般的检测方法。一个可接受的标准可能需要根据方 法的特性和检测的指标来确定。验证项目的选择可参照该指南后面所附的表8-推荐验证项目。在验证之前，应当为验证的分析方法提供一个清楚并简明的格式。该方法应提供所有必要的细节（参数、条件等）。可以用以下几种方式来描述这些在分析方法验证过程中将要用到的数据。在验证过程中得到的任何意外的或计划外的结果，在此都应当调查并形成文件（包括合理评估的取消某个无效数据）。任何超标的结果也应在验证报告中讨论并记录方法的局限性（若有）。方法应按照USP中名称分类，参照表 1。这里需指出并不是所有的分析方

5、法都适合这1到4类。有特殊的方法时，每个数据（以下）都应反复考虑其适用性以满足分析方法的目的。表1:分析项目检验类别IIIIIIIV定量，面积%，wt%定性精密度是是否是*准确度是是a*否检测限否*是*否定量限否是否*否报告限度否是否*否选择性是是是*是范围是是*否线性是是否*否中间精密度是是是是是耐用性是是*否*可能需要根据其自然特性作详细检测。a可能需要对相关响应因子（RRF）根据以下方法作进一步的检测。B、选择性：1、 要求：a）选择性的研究一般优先于其它验证项目。b）收集被分析物的相关文件（色谱图、分析报告、参考文献等），包括杂质、降解物、溶液、相关的或相近的相关物质。c）应有对典型样

6、品的分析。新方法应能对相关降解物和/或杂质具有明确性和选择性。若杂质或降解物的标准不存在，通过对含有杂质或降解物的产品用不同的程序来检测的结果进行对比来研究选择性，这个样品的成分应已得到鉴别确认。为了更适合，这应当包括快到有效期的或相关的强降解条件下的样品：光照、加热、湿度、酸碱水解、氧化等。2、 可接受标准：为证明选择性，需要有重要成分的积极响应和对一些干扰物质的响应的控制。鉴 别试验对降解物和杂质的选择性不作要求。c）精密度、回收率、线性和范围1、要求a）线性/回收率：准备两份样品（两份样品，分别在两天准备，每个浓度总共准备4份）+每天用新的标准（如果需要）。典型的做法是，准备的样品做成五

7、个不同的浓度。具体使用的浓度或多或少由产品本身和/或所使用的仪器决定。+注意：在预定的范围内分析物应该加入到合适的赋形剂或空白溶液中，应该用可靠的有代表性的分析试样（比如：大批量的 API ）。定量溶液的制备应该采用线性 /回收率制备的同一批样品，以免 引入研究的可变性。b）准确度一方法的精密度由分析的线性和回收率数据决定。c）范围一具体的范围一般是由线性数据和所要使用的程序决定。这些值的范围在分析方法中能够达到一定的线性、准确度和精密度。d）回收率（由线性/精确度评估）一是由测定单个样品时的 rsd的值得到，由每个浓度的四 个点组成的回收率决定的。2、 可接受的标准：所有数据都应符合表2的标

8、准。3、 报告：a）每个浓度的单个和平均百分含量（原料药验证）或回收率（最终产品的验证）都应 该计算和报 告。在API验证中，因为没有赋形剂，系数就用百分数表示。检出量回收率百分含量=X 100加入量表2 :一般方法可接受的标准范围（%）样品的每 个浓度准 备的份数精密度线性回收率精密度（%RSD）可接受的平均回收 率（与理论值对比）相关系数（R）斜率（m）含量API5A50150%每个浓度4份± 1%> 0.9900.95-1.05< 1%降解物含量 低剂量原料药5C0.05 150%每个浓度4份± 10% (> 0.5%)± 25%(V 0.

9、5%) B> 0.9500.875-1.125< 10%( > 0.5%)< 25%( V 0.5%)类别II降解物含量 咼剂量原料药5C0.03 150%每个浓度4份± 10% (> 1.0%)± 25%(V 1.0%) B> 0.9500.875-1.125< 10%( > 0.5%)< 25%( V 0.5%)A :根据不同的检测浓度需要实验证应包括低浓度的50%和高浓度的150%;B :如果线性关系在整个范围内不能得到满足，活性组分和降解的线性关系可以分开；C :下限代表主成分的水平，而上限代表降解物的水平;D

10、:应该在各个验证方案中先定义好紧缩或宽松的验收标准。b）这些数据应当表示为检出量比加入量，进行线性回归分析，根据以上要求测得的样品的结果进行绘制得到（每个浓度的四个点）。（y=mx+b，其中丫=检出量，m=斜率，x=加入量，b=截距）c）报告相关系数（R），斜率（m），和残差平方和。d）报告每次加入量浓度所得的回收数据的SD和RSD。6次）。典型D、测量精密度 1、要求一为确定测量精密度，同一化验员多次对同一样品进行检测（每个至少检测例子，对100%的标准溶液分析进行类别I的验证。类别II验证要求对标准品的规格和指标进行分析。2、可接受的标准：数据的RSD应符合表3的标准。对类别IV的含量没有

11、一个普遍接受的标准。3、 报告：报告检测的数据并计算平均值、标准偏差和%RSD。表3:测量和方法精密度的可接受标准（ %RSD）测量精密度样品/标准品方法精密度类别1原料药< 1%< 1%类别1制剂< 1%< 2.5%类别1防腐剂< 3%< 3%类别II 原料药&大剂量制 剂< 3%< 10% (等于或大于 0.5%)< 25% (小于 0.5%)类别II 小剂量制剂< 3%< 10% (等于或大于1%)< 25% (小于 1.0%)类别III< 3%< 5%E、方法精密度：1、 要求一为确定方法的方法

12、精密度，同一分析员将样品和标准溶液各准备6份。2、 可接受的标准一所有数据都应符合表3所给出的标准。对类别IV的含量没有一个普遍接受的 标准。3、 报告一每个样品的检测数据都应报告，包括平均值、标准偏差和%RSD。F、中间精密度1、要求a）为测定方法的中间精密度，两个分析员分别对至少三批样品（若有）的含量测定两次。分析操 作应分别在两天进行，在操作条件基本不变的情况下，用不同的仪器、不同的设备、 试剂、溶液、标准溶液，样品溶液进行小的变动。b）当分析物中的检测成分不存在时，可以加入相应标准使出现响应峰。2、可接受的标准 所有数据必须符合表4提供的标准。表4:中间精密度可接受标准类别要求标准（绝

13、对差）I含量：原料药± 1%II降解物含量：小剂量制剂± 0.2% (< 2%)± 0.5% (> 2%)II降解物含量：API&大剂量制剂± 0.1% (< 1%) ± 1% (> 1%)II残留溶剂浓度的土 25%a (< 1%) 浓度的土 10%a (> 1%)*浓度是指最初检测时的数据。注解：当一个分析物的检测结果低于报告限度时， 结果仍然要报告以便与其它有检测结果对比 （即 计算绝对差）。若一个分析物的检测结果为未检出，那在计算绝对差时应看作是 0。若两个分析物 的结果都是“未检出”或低于“

14、报告限度” ，那中间精密度可看做通过。3、报告一报告与中间精密度结果的对比的结果作为绝对差。每个分析都包括系统适应性结果和样品检测的定量结果（如适用）。G、检测限1、 要求a）按照一个恰当的方法来稀释分析物来确定检测限。稀释的倍数是直到分析物不能被检测 到为止。b）在做检测限测试的样品需平行测定三次以确认结果。2、 可接受的标准：以信噪比为3:1时的三针进样进行确认。 要注意检测限经常会受分析方法的条 件的影响，会因仪器和柱子等的不同而发生变化。3、报告一在方法的最后讨论中对检测限的结果报告。H、定量限I、要求：准备一份不含赋形剂或分析物的溶液，或一份由指定方法检测可能达到检测限的溶液。 其测

15、定结果应当具有一定的精密度、准确性和线性，并且是能够被定量测定的最低量。2、 可接受的标准：以信噪比为 10： 1时进样进行确认。定量限经常会受分析方法的条件的影响， 会因仪器和柱子等的不同而发生变化。3、报告一在方法的最后讨论中对定量限的结果报告。I、报告限度1、要求a）准备并分析一份在报告限度内的样品以得到典型图谱，放在分析方法中。一般而言， 限度应符 合表5中所例的ICH指南。在验证总结报告中应有对更高报告限度的证明。表5:报告限度*报告限度小剂量原料药（ 2g/天）0.05%大剂量原料药（ 2g/天）0.03%2、 可接受标准一定量限必须不大于给定的报告限度。（一般以信噪比为10： 1

16、时进样进行确认）3、报告一在最后的方法中的系统适应性部分中报告。J耐用性1、要求a）若测量法易受不同分析条件的影响，分析条件可以调整以便于测试。调整变化要符合耐用性要 求，典型调整变化有：样品制备、萃取时间、溶剂的成分、流动相的pH值的变化、不同的柱子、 温度、流速等等。一般而言，把一个标准品或系统适应性溶液用来分析，观察关键系 统适应性参 数（如分离度、信噪比等等）。表6中例举了一些 HPLC方法的变化。表6 HPLC方法的变化方法变量推存范围流速r ±10%缓冲液离子强度± 20%柱温:室温（20C -25 C）,周围环境温度应该 30C 40C其它所有温度为土 5C至

17、10C缓冲液的pH± 0.5个pH单位流动相成分有机相土 5%柱同一厂家的二个批号，若可以的话选两根柱子来自不 同厂家（相同的固定相、填充物和柱子的尺寸）检测波长± 5nmb）用不同时间段的样品和标准品溶液与新制的标准品溶液的对比结果来分析样品的稳定性（一般 每隔24小时到5天）。溶液应储存在预先设定的条件下，以模拟正常的实验室操作条件（如冷冻、冷藏或室温）。溶液的稳定性由方法中每次设定的时间点的计算结果决定，与每次时间为零时的溶液所测得的结果计算绝对差。2、可接受标准a）记录每次变化所得的效果。b）当预定的变化所测得的结果符合表7所给的结果时，样品和标准溶液可确定是稳定的

18、。表7样品/标准溶液稳定性可接受标准：与零点的绝对差（样品或标准品）类别1主成分± 1类别II降解物:± 0.1类别II杂质± 0.05类别III:士 33、报告a）在最后的报告中包括所有的耐用性参数或预先设定的条件。最后耐用性所得到的条件应在分析方法中以允差范围的形式描述（如调节pH值到2.9 ± 0.2 ）。b）样品的标准溶液的稳定性中应记录在环境中（如放置在实验室、冷藏等）持续的时间，并且在这段时间样品的成分没有改变。在每个时间点用标准品校正的含量结果都应报告。在最后的报告中，用于分析溶液的时限要明确的指出。K相对响应因子1、要求a）当用质量百分含

19、量报告产品的降解物和杂质时，用标准品（若有）测定相对响应因子。对每个 可获得的降解物或杂质的分析，每次制备两份溶液含1.0%的降解物或杂质包括 100%的活性成分。若给定的降解物和杂质时所测得的相关响应系数的值的范围在0.8-1.2之外时，那就作为校正系 数在最后的计算中算入，以对降解物和杂质进行定量。若因为不存在降解物而无法 检测到相关系 数时，那相关系数就定为1.0。b）若降解物的标准是作为方法的一部分，就要对已知样品的纯度计算公式进行校正。c）用到了已知浓度的降解物或已知峰面积的杂质，那相对响应因子的计算如下式：面积DeG浓度DEGRRF=面积PARENT浓度PARENT2、报告a）对每

20、个降解物或杂质的研究都应报告。b）在降解物或杂质的计算中包括RRF值。L、验证报告摘要验证总结报告应当包括以下几个方面的内容：1、目的一记录验证的目的、方法改进的背景、所提供的原料药或产品、仪器概要和参考文献。2、验证的项目a）验证项目的结果（如精密度、耐用性等等）应在报告中列出来。b）包括所有用到的标准品、样品、报告限度、稀释剂、赋形剂和系统适应性溶液的色谱图。c）分析方法验证应该提供完整文件。包括为解释某一重要的数据所例的图表。d）最后的报告数据应当列出适当的有效数据。该验收标准不包括在最后的报告中所要报告的有 效数据的个数。3、 分析方法a）方法对细节描述应该充分，并给出合适的格式与适当

21、的数字和表格。b）方法中应当包括操作参数和操作法。如用臂摇设备，方法才能成功；而在平台上摇，方法就会失败时。则用臂摇的方法就需要详细的说明。当有多种操作方法时，方法验证试验应选择多个进行检测。c）操作规程中应写明试剂配制方法和试剂稳定储存的周围环境光照和温度条件。应包括特殊处理 要求（如避光、使用棕色玻璃瓶等）。d）可能发生的任何物理作用（如因为与PEEK管的相互作用而产生的不可重现性）或化学反应（光/热敏性）都应描述并作为参考。4、偏差一在验证报告中应当有一单独的部分对验证过程中出现的任何偏差或突发事情进行描述。 以于更多的细节的总结也可以提供一个参考文件的清单，参考文件清单上要写明文件的题目和日 期。0 '可能需要根据其自然特性做特定检测。*当制剂和组分含量检测方法相同时则在制剂