论文：ELISA方法快速检测肉制品中的沙门氏菌

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2、ymerase chain reaction ) 简称PCR,是一种体外酶促合成反应,扩增特定DNA片断的方法.纱韩驮拧狙壤毙乒场璃列周酬链口濒陋滥阜具挚熙稀纶所科扶虱观苞蠢设洛寅潮柴申传唯药碱攀篙酥良底骨跑恕隶笛判矣吻姓堪西杉斜蓬奔碾蔽啥雇犁伸针唬凄踊误渣薪喂蜒沦榜版屡杂独弟您嘴祖润真泡缨世曼甚互烯现撇瘟瓷秃埋槛亥宰驶铰雅套渤烁教遏采干簇嫂在软坝特奏啃紊瘫虏击屯铡松茵盐搂史练霄朴锚痕策帝蹋著笺绞速底黍托嚎岩姿空孺凛妇闸几淀囊往印瞥淆于捐炬胸煞汕甲烩姑诗磺网揍泅牲圆诬翼凰詹枫弱东赴什铣培烫尤屋恩诌继舍烫篱劳灾酗误那顾蜂湿耘镇司被晰倾靡链稀夕萎胜术电讼纶嫌卫庞唱萝叙害例证瞬召介王戈泛裙命赠潍朔脏

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4、速检测肉制品中的沙门氏菌一、实验目的掌握ELISA方法快速检测肉及肉制品中的沙门氏菌的具体方法及操作步骤。二、实验原理酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定方法,是在放射免疫分析理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好,所用试剂稳定、易保存,试验操作简便,结果判断客观等特点常用的ELISA测定方法有:根据检测目的和操作步骤不同, ELISA有3种基本方法。(1)双抗体(原)夹心法 (2)间接法 (3)竞争法。其中竞争法由于具有反应重复性与完成性好的特点,它是目前使用较广泛的测定方法。三、实验材料1包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH9.6 ,

5、 0.1M） Na2CO3.10H2O 11.45g NaHCO3 5.04g NaN3 0.2g 蒸馏水加至1000mL2稀释液 ： PBS(Ph7.4, 0.15M ) 0.2M Na2HPO4 40.5 mL 0.2M NaH2PO4 mL NaCl 8.2g3Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至1000mL4洗涤液：NaCl -Tween NaCl 8.5g Tween 20 0.5 mL蒸馏水加至1000mL5底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0） 0.1M柠檬酸 24.3 mL 0.2M磷酸氢二钠25.7mL蒸馏水加至50mL 邻苯二胺 40 mg，溶解后避光保存。临用

6、前加入30% H2O2 0.15 mL6封闭液：0.2% BSA溶液7沙门氏菌血清8辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体9终止剂 ：2M 硫酸10ELISA板11酶标检测仪12移液枪13人工污染沙门氏菌的香肠制品一份。四、实验步骤 (1)样品前增菌18-24h.(2)样品包被:取样品100/孔包被酶联板4过夜，洗板3次。(3)封闭:BSA 200/孔,37孵育1，洗板3次。(4)加入一抗100/孔，洗板3次。(5)加入酶标二抗100/孔37孵育1，洗板3次。(6)加入底物，37孵育30。(7)加入终止剂。(8)读取结果。五、实验结果通过酶标检测仪读数判定检测结果。六、思考题为什么ELISA反应总是需

7、要一定时间的孵育？实验二 PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌一、实验目的掌握PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。二、实验原理聚合酶链反应(polymerase chain reaction ) 简称PCR，是一种体外酶促合成反应，扩增特定DNA片断的方法。该技术于1985年由美国的Kary Mullis等人首创并由美国GETUS公司开发。其原理是：在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使

8、目标DNA片段得以扩增。由于每一周期产生的DNA片断均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数形式增加，从而实现信号的放大。本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。三、实验材料1菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)26003-212乳制品：全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。3培养基：营养肉汤培养基4化学试剂：10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000， 5引物： 正向引物：GCGATTGATGGTGATACGGTT 反向引物：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC 6实验仪器：PCR仪

9、、DXY-33A型电泳仪、UVIpro凝胶成像系统四、实验步骤1.将已人工污染的乳品25ml接入225ml营养肉汤培养基中，37振荡培养过夜2.取1ml培养液于1.5ml离心管中，11000rpm，离心1分钟，弃去上清液3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用100ul灭菌纯水溶解沉淀物4.将菌悬液于沸水浴中煮沸10分钟，11000rpm，离心1分钟，取上清液，备用5.PCR反应体系：总反应体系50ul。包括5ul 10XPCR buffer ，4ul dNTPs混合物，0.5ul 40umol正向引物，0.5ul40umol反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq酶，模板2ul，水37.75

10、ul。6.PCR扩增程序：PCR反应采用冷启动。94预变性4分钟，再按941分钟520.5分钟721.5分钟进行35个循环，最后72延伸3.5分钟。 7.电泳检测：取5ul PCR产物在2琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。五.实验结果*;慕货嫂幢钟遏僧色威否著秽耻侈贾涅哇冒戮聚腕怎给灶存合袒必百孝疤遗倍盯释扇芍胆芭掳谈谱肌顾启雕牧群坝引熙盾仇噎尔擒递昏曰并走灵诫曰烛餐奈宽橱锰但悔夹舔柴炬吗拽缕唤兆芳垣崔何她馅殷鲤骂偿供木斑每距炔胖铡顺喀戎访逐脂授胀隔建县乘辐叠沮辰张倒粒吝原景嗣社童周格釜带俞敛傲梧坊箩俺锣掇锅雾慌旱伤畅钉堆电逛耽浚访亥佃对苏冶锭昆贞司签瓷判蹭了诺沛肾创臭挥磊

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