内源性硫化氢在脂多糖引起的肺动脉高压中的作用

1、211生理学报 Acta Physiologica Sinica , April 25, 2008, 60 (2): 211-215 内源性硫化氢在脂多糖引起的肺动脉高压中的作用黄新莉*，周晓红，韦 鹏，张晓静，孟祥艳，羡晓辉河北医科大学病理生理学教研室，石家庄050017摘要：为观察硫化氢(hydrogen sulfide, H 2S)在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的肺动脉高压中的作用，应用离体血管 环张力测定方法测定肺动脉反应性，米用生物化学方法测定肺动脉组织中H?S产出率和胱硫醚-y裂解酶(cystathionine ylyase,CSE)活性，定量PCR

2、方法测定肺动脉组织中CSE表达水平。结果如下：(1)与对照组相比，LPS可显著升高肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP) (1.82±0.29) kPa (1.43 ±0.26) kPa,P<0.01，降低肺动脉组织中H?S 产出率(26.33 ± 7.84s (42.92 ± 8.73) pmol/g wet tissue per minute,<0.01和 ACh 诱导的肺动脉内皮依赖性舒张反应(75.72 ± 7.22)%s(86.40 ± 4.40)%,P<

3、;0.01 ; (2) NaHS可部分逆转上述变化，而 PPG加剧上述变化；(3) CSE活性和CSE mRNA 表达的变化 与H2S产出率的变化相同。结果提示，LPS对内皮依赖性舒张反应的抑制导致肺动脉高压的发生，此作用可能与H2S有关。关键词：脂多糖；硫化氢；肺动脉高压中图分类号：R6 31.4Role of en doge nous hydroge n sulfide in pul monary hyperte nsion in duced by lipopolysaccharideHUANG Xin-Li *, ZHOU Xiao-Ho ng, WEI Pe ng, ZHANG Xia

4、o-Ji ng, MENG Xia ng-Ya n, XIAN Xiao-HuiDepartment of Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, ChinaAbstract: The purpose of the present study was to explore the role of endogenous hydrogen sulfide (H 2 S) in pulmonary arterial hypertension induced by endotoxin. Adult male Spr

5、ague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups: Control group (0.5 mL/kg body weight of normal saline, i.v.), lipopolysaccharide (LPS)-treated group (5 mg/kg body weight of LPS, i.v.), LPS + NaHS (5 mg/kg body weight of LPS, i.v., and 28 ；imol/kg body weight of NaHS, i.p.) and LPS + PP

6、G group (5 mg/kg body weight of LPS, i.v., and 30 unol/kg body weight of PPG, i.p.). Rats were anesthetized with 20% urethane (1 g/kg body weight, i.p.). A polyethylene catheter was inserted into the pulmonary artery through the right external jugular vein to measure the mean pulmonary arterial pres

7、sure (mPAP) for 7 h, and then the pulmonary artery was isolated rapidly by the method described previously. Pulmonary arterial activity was detected. H2S concentration and cystathionine Ylyase (CSE) activity in pulmonary artery tissues were determined by biochemical method. CSE mRNA expression was d

8、etected by competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Compared with control, LPS significantly increased mPAP (1.82vs 0.243 kP± 0.26) kP<0.01, decreased HS production (26.33±7(42)92 ± 8.73)pmol/g wet tissue per minute, P<0.01), and reduced endothelium-

9、dependent relaxation response (75.72vs (86.±07.2±)%)40)%,P<0.01) induced by ACh (1 x tttol/L). These effects were partly reversed by co-administration of NaHS and enhanced by coadministration of PPG. Both CSE activity and CSE mRNA expression were consistent with H2S production. It is su

10、ggested that theinhibitory effect of LPS on endothelium-dependent relaxation results in pulmonary hypertension, which might be mediated through H 2S.Key words: lipopolysaccharide; hydrogen sulfide; pulmonary hypertensionReceived 2007-09-14 Accepted 2007-11-05This work was supported by the Natural Sc

11、ience Foundation of Hebei Province (No. C2007000830), the Science Foundation of the Department of Science and Technology of Hebei Province (No. 06276102D-24, 052761344), the Educational Committee of Hebei Province (No. 2005123) and the Science Foundation for Youths of Hebei Medical University (No. 0

12、000038).'Corresponding author. Tel: +86-311-86265645; E-mail: huangxinli2006黄新莉等：内源性硫化氢在脂多糖引起的肺动脉高压中的作用217革兰氏阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)是导致内毒素休克的主要因 素。在内毒素休克早期，主要的血流动力学紊乱 常表现为体循环低血压和肺动脉高压，后者是内毒 素造成肺损伤的早期表现之一2。我们以前的研究发现，LPS可通过损伤肺动脉内皮细胞，从而抑制 肺动脉内皮依赖性舒张反应，导致肺组织损伤。已有实验证明，LPS的损伤作用与许多炎

13、症介质如 炎症因子、NO、CO等有关4,5，但LPS所致肺动 脉高压的确切机制仍不清楚。体内由胱硫醚-y裂解酶(cystathionine 丫lyase, CSE)催化半胱氨酸产生的 硫化氢(hydrogen sulfide, H 2S)是一种小分子气体， 人们推测H2S可能是继NO和CO之后的第三种气体 信号分子，但关于H 2S的生理和病理作用尚不清 楚。有研究证实，与NO、CO相似，H2S也具有舒张血管和抑制血管平滑肌增殖的作用，可以缓解 缺氧性肺动脉高压 ；还有实验证明，内源性H2S与NO协同作用舒张血管和胃肠道平滑肌8,9。提示H2S参与了内毒素休克时肺动脉反应性的调节。本 文旨在观察

14、H2S在LPS引起的肺动脉高压中的作用。 实验中采用NaHS溶液提供外源性H2S。据报道体内 1/3的H2S以气体形式存在口。NaHS在体内可解离 成Na+和HS-,后者与H +结合生成H2S, H2S和NaHS 形成动态平衡。NaHS可以保证溶液中H2S浓度的稳 定，因此文献上干预实验多采用NaHS溶液。1材料与方法1.1材料 大肠杆菌LPS (0111:B4)、苯肾上腺 素(phenylephrine , PE , a肾上腺素受体激动剂)、ACh、NaHS和PPG均购自美国 Sigma公司。TRIzol 试剂盒购自美国 Gibco公司。dNTP、M-MuLV 逆 转录酶、Taq DNA聚合

15、酶、RNA酶抑制剂和oligod (T)15引物均购自美国 Promega公司。6对CSE引物 由中国北京赛百胜公司合成。1.2方法1.2.1肺动脉高压模型和肺动脉环的制备雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠体重 220 g左右(由河北 省实验动物中心提供)，随机分为4组(n=812)。对 照组：经尾静脉注射生理盐水(0.5 mL/kg 体重);LPS组：经尾静脉注射 LPS (5 mg/kg体重);LPS + NaHS组：注射LPS前10 min腹腔注射 NaHS (28 mol/kg 体重);LPS + PPG 组：注射 LPS 前 10 min 腹腔注射PPG (30 pmol

16、/kg体重)。大鼠腹腔注射乌拉坦(1 g/kg 体重)麻醉，将肺动脉导管 (PE -50 , Intramedic, New York, NY)经右颈外静脉插管抵达肺 动脉，用生理多导仪(成都泰盟电子有限公司)测定 肺动脉平均压 (mean pulmonary arterial pressure, mPAP)，直至LPS注入后7 h。参照Sheridan等方 法10,11制备肺动脉环：打开胸腔迅速取出肺动脉， 置于 4 °C 改良 Krebs 液中(in mmol/L) : NaCl 120、 KCl 5.5、CaCl2 2.5、NaH 2PO4 1.2、NaHCO 3 20、 Mg

17、Cl 2 62O 1.2、葡萄糖 10 , pH 7.27.4 。仔细 去除血管外膜后把肺动脉切成3 mm宽的肺动脉环，注意避免损伤血管内皮细胞。制备好的肺动脉环用 于血管张力、H?S产出率、CSE活性测定及提取RNA。1.2.2肺动脉张力测定参照Liu等12报道的方法，把肺动脉环垂直挂于夹层器官槽中，一端固定 于槽底部，一端通过张力换能器与平台记录仪(四川仪表总厂)相连。槽中含有 6 mL 37 oC恒温等渗 的Krebs液，并持续充入 95% O2-5% CO 2混合气体。 每组选用812个肺动脉环用于实验(1个环/大鼠)。 血管环在1 g张力下平衡1 h，每15 min换液一次。 用平台

18、记录仪描记血管环张力变化。用1X 106 mol/LPE检测肺动脉环的反应性，待反应稳定后，在PE(1 x 10mol/L)预收缩的血管环上观察对1 x 10 mol/LACh的内皮依赖性舒张反应。舒张反应变化用舒张 张力/PE收缩张力 x 100%表示。1.2.3 H 2S产出率测定根据Stipanuk等方法13,14稍作改良测定肺动脉组织H?S产生率。根据H2S浓度标准曲线计算肺动脉组织中H2S产出率，以每克组织每分钟生成 H2S的量表示(pmol/g wet tissue per minute)。1.2.4 CSE活性测定参照文献15方法进行。取大鼠肺动脉和肺组织在冰冷的磷酸钾缓冲液(5

19、 0mmol/L, pH 6.8)中研磨成匀浆。反应在25 mL锥形瓶中进行。反应体积1 mL ,含磷酸钾缓冲液(100mmol/L, pH 7.4)、L-半胱氨酸(10 mmol/L)、5 '磷 酸吡哆醛(2 mmol/L)和10% ( V/V)组织匀浆。在中 央室中加入10% (W/W)醋酸锌0.5 mL,并放入滤纸 增加吸收面积。用 也将烧瓶充盈30 s后，石蜡膜 封口，转移到37 oC水浴摇床中开始反应，90 min后向其中注入50% ( W/W)三氯醋酸0.5 mL中止反 应，继续水浴60 min后将中央室的内容物转移到含 3.5 mL蒸馏水的试管中，加入 20 mmol/L

20、对苯二胺 盐酸盐 0.5 mL 和 30 mmol/L FeCl 3 0.4 mL。室温孵育20 min后用分光光度计在波长 510 nm处检测溶液 吸光度。根据 H2S标准曲线计算溶液中H2S含量，组织中CSE活性以每毫克组织在单位时间内生成H2S的量(pmol/mg protein per minute) 表示。1.2.5 定量RT-PCR分析参见文献方法16,17。提取正常大鼠肺动脉总 RNA，逆转录合成cDNA作 为模板，用CSE-S及CSE-A引物进行PCR扩增。用 CSE-T 和 CSE-A 扩增一段 400 bp 的 CSE cDNA，然 后用CSE-S及CSE-A作为引物，两次

21、 PCR得到361 bp的DNA片段，它的序列和上述 400 bp的序列相 同，但在CSE S引物序列的下游缺失 39 bp。该361 pb的DNA片段用作 CSE mRNA RT-PCR定量的竞争 性内标准。为了便于保存和定量，将这两个片段的DNA 分别克隆至 pBluescript (SK+)的 Ecor RV 位点 中，质粒经扩增、纯化、Bam HI酶切线性化和紫外分光光度法定量后备用。定量PCR反应体系20此，包括cDNA 2 止,2.37 fmol/L 竞争性内标准 质粒(1此)及其它PCR反应必需试剂。30个循环 后，取6此反应产物以2%琼脂糖凝胶电泳分离和 溴化乙锭染色，用凝胶成

22、像分析系统测得400 bp和361 bp两条带的光密度，计算两条带的光密度之 比。以系列稀释的竞争性内标准(CSE cDNA 质粒)代替竞争性PCR反应体系中的模板 cDNA，在其它 条件均相同的情况下进行扩增后绘制标准曲线。根 据标准曲线计算出CSE cDNA 的相对含量，作为CSE mRNA的相对含量。然后取 2山上述PCR产 物，做3-actin的PCR扩增，用来校正前面 cDNA 逆转录时的RNA加样误差，其目的片段长度为291bp。cDNA第一链的合成体系为 25山，含1用肺 动脉组织总RNA，反应所用引物为 oligod(T) 15，在 标准逆转录反应条件下合成cDNA。CSE目的

23、片段的合成体系为20此，反应条件：94 oC变性1 min , 94 oC 变性 30 s , 57 oC 30 s , 72 °C 30 s 循环 30 次， 最后72 °c 1 min。 CSE引物序列(GenBankTM登录号AY032875) 为：CSE-S : 5' -TCCGGATGGAGA- AACACTTC-3' CSE-A : 5' -GCTGCCTTTAAAG-CTTGACC-3 ; CSE-T : 5' -GAAACACTTCCCCC- GGGTAGAAAAGGTTAT-3 。俟actin 引物序列为： 3-actin-

24、S : 5' -ATCTGGCACCACACCTTC-3 ；伕 actin-A : 5' -AGCCAGGTCCAGACGCA-3 ; 3-actin- T : 5' -GGTCCAGACGCAGACAATGCCAGTGGT- ACGC-3'。1.3 统计学分析 数据用mean± SD表示，用 SPSS软件进行分析，组间差异用单因素方差分析 (one way ANOVA),有显著差异者用 Newman-Kuels q检验进行两两比较。P<0.05为有统计学差异。2结果2.1肺动脉压力变化LPS组大鼠呈现明显的肺动脉高压，mPAP较对照组升高 27

25、.3% ( P<0.01)。LPS + NaHS 组大鼠 的肺动脉高压较LPS组明显减轻，mPAP降低19.8% (P<0.01)，而LPS + PPG 组大鼠的肺动脉高压较 LPS 组加重，mPAP 增高 7.7% ( P<0.05)(表 1)。 2.2肺动脉反应性改变与对照组比较，LPS组大鼠肺动脉环对 a肾上 腺素受体激动剂PE (1 X 10 mol/L)的收缩反应没有变 化，对1X 1(fmol/L ACh肺动脉内皮依赖性舒张反应 明显降低(P<0.01) , NaHS可逆转此变化(P<0.01), 而PPG加重该变化(P<0.01)(表1)。2.

26、3 H 2S产出率和 CSE活性变化正常对照组大鼠肺动脉组织H2S产出率为(42.92 ± 8.73) pmol/g wet tissue per min ute。与正常对照组相比，LPS使肺动脉组织 H?S产出率降低38.7% (P<0.01);与 LPS 组相比，LPS + NaHS 组大鼠 H2S 产出率增高 83.7% ( P<0.01)，而LPS + PPG 组大 鼠H?S产出率降低 26.6% ( P<0.05)(表2)。GroupMean pulmonary arterial pressure (kPa)Relaxation response of p

27、ulmonary artery (%)Pre-administrationPost-administrationControl1.50 ± 0.191.43 ± 0.2686.40 ± 4.40LPS1.47 ± 0.251.82 ± 0.2975.72 ± 7.22LPS + NaHS1.43 ± 0.261.46 ± 0.3185.92 ± 2.8#fLPS + PPG1.45 ± 0.211.96 ± 0.2565.18 ± 4.0#5表1.大鼠肺动脉压和肺动脉内皮依赖

28、性舒张反应的比较Table 1. Comparison of mean pulmonary arterial pressure and endothelium-dependent relaxation response to ACh in rat pulmonary artery# #P<0.01 vs control group; P<0.05,P<0.01 vs LPS group. n=8.正常对照组大鼠肺动脉组织 CSE活性为(831.8 ±GroupH 2S production (pmol/g wet tissue per minute)Activity

29、 of CSE(pmol/mg protein per minute)CSE mRNA(x 1-0 fmol/L)Control42.92 + 8.73831.8 + 70.52.17 + 0.22LPS26.33 + 7.84648.0 + 65.*71.02 + 0.1*5LPS + NaHS48.36 + 9.0#2827.4 + 86.23.13 + 0.20LPS + PPG19.32 + 4.8#5605.1 + 86.40.89 + 0.1#2表2.大鼠肺动脉组织CSE活性和CSE mRNA表达比较Table 2. Comparison of H2S production, CS

30、E activity and CSE mRNA expression in rat pulmonary artery# #P<0.01 vs control group; P<0.05,P<0.01 vs LPS group. n=8.70.5) pmol/mg protein per minute 。各组 CSE 活性的 变化趋势与H?S产出率的变化趋势相一致：与正常 对照组相比，LPS可使肺动脉组织 CSE活性明显降 低 22.1% ( P<0.01);与 LPS 组相比，LPS + NaHS 组大鼠CSE活性增高 27.7% ( P<0.01)，而LPS +

31、 PPG组大鼠CSE活性降低6.4% ( P<0.05)(表2)。2.4 CSE mRNA 表达变化定量RT-PCR测定发现，LPS组大鼠肺动脉组织中CSE mRNA 表达较对照组降低 53.9% ( P<0.01)， LPS + NaHS 组 CSE mRNA 表达较 LPS组增高 206.9% (P<0.01)，而 LPS + PPG 组 CSE mRNA 表达较 LPS 组降低 12.75% ( P<0.05)(表 2、图 1)。2345图 1. CSE mRNA RT-PCR 产物电泳图谱Fig. 1. Electrophoresis of RT-PCR pro

32、duct of CSE mRNA. 1, marker; 2, control; 3, LPS; 4, LPS + NaHS; 5, LPS + PPG. The two bands in agarose gel stained by ethidium bromide were CSE wild type fragment (400 bp) and CSE competitive internal standard (361 bp), respectively. Since the amount of the competitive internal standard added was id

33、entical in each PCR reaction, the ratio of the optical density of CSE wild type/CSE competitive internal standard represented the relative amount of wild type CSE mRNA in sample.3讨论最近我们研究发现，LPS所致的肺动脉内皮依赖性舒张反应减弱在内毒素休克时的肺动脉高压中 发挥重要作用。内源性气体信号分子因其具有持续 产生、传播迅速等特点，对肺循环的作用比其它舒 血管因子更具有特殊意义。已有实验证实，内源性 气体信号分子

34、NO和CO均参与了 LPS引起的肺血管 反应性异常的发生4,18，但是基于此而采用的小剂 量NO、CO吸入疗法并不能有效改善此时的肺血管 反应紊乱，提示还有其它内源性气体信号分子参与 上述肺血管反应性的调节19,20。H2S 一直被认为是一种有毒气体，但最近研究发现它可能是继NO和CO之后的第三种内源性气体信号分子，具有重要 的生理作用。体内 H2S是由多种酶催化分解含硫氨 基酸如甲硫氨酸、L-半胱氨酸和同型半胱氨酸的过 程中产生的，最主要的酶有胱硫醚-3-合成酶(cystathionine 3-synthase, CBS)、CSE，但血管组 织中只有CSE的表达9。文献报道，作为内源性气体信

35、号分子的H2S,在大鼠血清中含量约为46 (imol/L。生理情况下，门静脉和胸主动脉中 H?S产出率分别为(19.6 ± 2.和 (33.7 ± 2.2) nmol/g protein per minute9。已有研究证 实，H2S是血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)中Katp通道的气体性开放剂，后者可 引起VSMCs膜超极化，从而导致 VSMCs舒张21。 Zhao等22进一步研究发现，H?S的舒血管效应可能 与其可增加内皮依赖性超极化因子和内皮细胞来源 的NO释放有关。本实验中，我们通过整体和离体实验探讨了H2S

36、在肺动脉反应性调节中的作用。结果发现， LPS所致的肺动脉高压大鼠中肺动脉组织H2S产出率明显下降，与 CSE活性和CSE mRNA 表达明显 下降相一致。腹腔给予NaHS (28 imol/kg体重)降低肺动脉压力，同时使肺动脉组织H?S产出率显著增加、CSE活性增强、CSE mRNA 表达增加。而CSE抑制剂PPG却使LPS所致的肺动脉高压大鼠中 肺动脉压力进一步增高。我们的研究提示，LPS对内皮依赖性舒张反应 的抑制导致肺动脉高压发生，此作用可能通过调节 H2S的生成来实现的。参考文献1 Meng AH, Ling YL, Zhang XP, Zhang JL. Anti-inflamm

37、atory effect of cholecystokinin and its signal transduction mechanism in endotoxic shock rat. World J Gastroenterol 2002; 8(4): 712-717.2 Sheridan BC, McIntyre RC Jr, Moore EE, Meldrum DR, Agrafojo J, Fullerton DA. Neutrophils mediate pulmonary vasomotor dysfunction in endotoxin-induced acute lung i

38、njury. J Trauma 1997; 42(3): 391-397.3 Gu ZY (谷振勇),Ling YL, Meng AH, Cong B, Huang SS. Effects of cholecystokinin octapeptide on the response of rabbit pulomonary artery induced by LPS in vitro . Chin J Pathophysiol (中国病理生理杂志)1999; 15(6): 484-487 (Chinese, English abstract).4 Huang XL (黄新莉),Ling YQ,

39、 Zhu TN, Zhang JL, Ling YL. Multiple factors contributing to lipopolysaccharide-induced reactivity changes in rabbit pulmonary artery. Acta Physiol Sin (生理学报)2005; 57(6): 737-741 (Chinese, English abstract).5 Meng AH (孟爱宏),Ling YL, Wang DH, Gu ZY, Li SJ, Zhu TN. Cholecystokinin-octapeptide alleviate

40、s tumor necrosis factor-alpha induced changes in rabbit pulmonary arterial reactivity and injuries of endothelium in vitro . Acta Physiol Sin(生理学报)2000; 52 (6): 502-506 (Chinese, English abstract).6 Wang R. Two ' s company, three ' s crowdSdae tHe third endogenous gasous transmitter? FASEB J

41、 2002; 16(13): 17921798.7 Zhang QY, Du JB, Zhou WJ, Yan H, Tang CS, Zhang CY. Impact of hydrogen sulfide on carbon monoxide/heme oxygenase pathway in the pathogenesis of hypoxic pulmonary hypertension. Biochem Biophys Res Commun 2004; 317(1): 30-37.8 Teague B, Asiedu S, Moore PK. The smooth muscle r

42、elaxant effect of hydrogen sulfide in vitro evidence for a physiological role to control intestinal contractility. Br J Pharmacol 2002; 137(2): 139-145.9 Hosoki R, Matsuki N, Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide. Biochem

43、 Biophys Res Commun 1997; 237(3): 527-531.10 Lin SL, Lee YM, Chang HY, Cheng YW, Yen MH. Effects of naltrexone on lipopolysaccharide-induced sepsis in rats. J Biomed Sci 2005; 12(2): 431-440.11 Sheridan BC, McIntyre RC, Meldrum DR, Meng X, Fullerton DA. Endotoxin stuns cGMP-mediated pulmonary vasore

44、laxation. Shock 1997; 8(3): 207-212.12 Liu JQ, Erbynn EM, Folz RJ. Chronic hypoxia-enhanced murine pulmonary vasoconstriction: role of superoxide and gp91phox. Chest 2005; 128(Suppl 6): 594S-596S.13 Li XH, Du JB, Shi L, Li J, Tang XY, Qi JG, Wei B, Jin HF, Tang CS. Down-regulation of endogenous hydrogen sulfide pathway in pulmonary hypertension and pulmonary vascular stru