医疗器械的无菌和初始污染菌检验.PPT

1、1医疗器械无菌和初始污染菌医疗器械无菌和初始污染菌检验技术检验技术国家食品药品监督管理局国家食品药品监督管理局北京医疗器械质量监督检验中心北京医疗器械质量监督检验中心2医疗器械无菌检验技术医疗器械无菌检验技术3什么是无菌检查法？ 用于检查要求无菌的医疗器械是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌试验的目的：将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。4医疗器械无菌检验标准GB/T 14233.2 -2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法2010年版中国药典无菌检查法5医疗器械无

2、菌试验检查要点指南（2010版） 无菌检验是无菌医疗器械产品生产控制过程中的一项重要内容。其检验方法、检验结果判定及检验人员业务能力等因素直接影响产品的质量和安全。作为无菌医疗器械生产企业，其无菌检验工作应由本企业独立完成。并要求企业的检验人员能当场操作或口述无菌检验的过程。 6 灭菌: 杀灭或除去特定环境或物品中一切微生物的过程。目前国际上规定，灭菌过程必须使灭菌物品污染的微生物存活率减少到10-6及以下。 微生物: 必须用光学显微镜或电子显微镜才能观察到的微小生物。微生物具有一定的形态与结构,并能在适宜的环境中迅速地生长和繁殖,如细菌、病毒、真菌等。 无菌：是指某一物体或某一环境中不含有活

3、的微生物。 无菌技术:是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材以及无菌操作。7 无菌操作:是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。 培养条件：用于促进微生物发育、生长和繁殖的生长培养基和培养方式的组合。 抑细菌/抑霉菌试验：用选定的微生物来演示某些物质的存在能够抑制这些微生物的繁殖。 培养基: 是人工配制的生物营养物质，即用人工的方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一种混合营养物。8 促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物 生长的技术操

4、作。 假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。 假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。 需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。 厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。 无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物的概率。9 细菌：为单细胞微生物,其细胞分化不完善，无完整细胞核及核膜、核仁，直径一般为1m 10m。10 真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善，有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径一般为10m 100m。11医疗器械无菌检验所需设备 超净工作台超净工作台12医疗器械无菌检验所需设备恒温培养箱（至少恒温培养箱（至少2 2台）台）1

5、3医疗器械无菌检验所需设备压力蒸汽灭菌器压力蒸汽灭菌器14医疗器械无菌检验所需设备电热干燥箱电热干燥箱15医疗器械无菌检验所需设备集菌仪集菌仪16医疗器械无菌检验所需设备生物安全柜生物安全柜:（从试从试验安全性考虑，建验安全性考虑，建议阳性对照试验使议阳性对照试验使用生物安全柜）用生物安全柜）17医疗器械无菌检验所需设备电子天平电子天平18医疗器械无菌检验所需设备光学显微镜光学显微镜19医疗器械无菌检验所需设备过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子） 20 无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流

6、空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心和严谨细致的工作作风。环境及人员要求环境及人员要求21 无菌检查法 环境要求22隔离系统隔离系统无菌检查法 环境要求23 无无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落

7、数。 无菌检查法 环境要求TSA琼脂琼脂平皿平皿在在3030 3535培培养养48h48h证明无菌证明无菌取取3 3只只放放无菌操作无菌操作台或超台或超净净工作台平工作台平均位置打开上盖，均位置打开上盖，暴露暴露30min30min后盖好后盖好3 3只培养皿上只培养皿上生长的菌落生长的菌落数平均应不数平均应不超过超过1 1个个无菌试验过程中无菌试验过程中也也应检查空气中的菌落数，方法应检查空气中的菌落数，方法要求要求同上同上24无菌检查法 试验前准备 器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内12130min，或置电热干燥箱内1602h。 培养基：可按药典中的处方制

8、备培养基，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2 25，一般在3周内使用。25无菌检查法 试验前准备 配制培养基所需器具配制培养基所需器具: : 26无菌检查法 试验前准备常用器具与稀释液常用器具与稀释液: : 27无菌检查法 试验前准备培养基培养基: : 28无菌检查法 试验前准备 硫乙醇酸盐流体培养基: 在供试品接种前, 培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则,须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却,只限加热一次，并应防止被污染。其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基

9、深度的 1/2。30 35培养14天。 需氧菌需氧菌生长生长厌氧菌厌氧菌生长生长29无菌检查法 试验前准备100水浴水浴加热加热30无菌检查法 试验前准备培养基培养基: : 31无菌检查法 试验前准备 改良马丁培养基：改良马丁培养基： 23 23 2828培养培养1414天天32无菌检查法 试验前准备培养基培养基: : 33 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 无菌性检查 每批培养基随机不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。培养基的适用性检查34灵敏度检查： 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得

10、的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)CMCC（B） 26 003 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC（B） 10 104 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ) CMCC（B） 63 501 生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes) CMCC(B) 64 941 白色念珠菌 (Candidaalbicans) CMCC(F) 98 001 黑曲霉 (Aspergillus niger ) CMCC(F) 98 003培养

11、基的适用性检查35菌液制备： 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养18小时24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，（2328）培养（2448）小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL 含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。培养基的适用性检查36 菌液制备：接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，（2328）培养（57）天，加入（35）mL含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱

12、。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL 含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在（28）可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在（28），在验证过的贮存期内使用 。 培养基的适用性检查37 平板划线法-斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线（3-4）条，再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。培养基的适用性检查 平板划线法-

13、曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。38 培养基的适用性检查血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）（大的金黄色菌落）在划线过程中，细胞逐渐分散，培养后可形成单个菌落。在划线过程中，细胞逐渐分散，培养后可形成单个菌落。39 定期移植法定期移植法: :亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(46)进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。方法。 操作步骤：操

14、作步骤： 斜面制备斜面制备 接种接种 培养培养 保藏保藏培养基的适用性检查40v 接接 种种41培养基应符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。灵敏度检查所用菌种灵敏度检查所用菌种（药典（药典20102010版规定）版规定）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉分别接种各菌分别接种各菌种新鲜培养物种新鲜培养物至相应培养基至相应培养基中培养，将培中培养，将培养物用养物用0.9%0.9%无无菌氯化钠溶液菌氯化钠溶液制成菌悬液制成菌悬液（浓度小于（浓度小于100cf

15、u/mL100cfu/mL）硫乙醇酸盐流体硫乙醇酸盐流体培养基（培养基（12mL12mL）9 9支：支：分别接种分别接种小于小于100cfu100cfu的金的金葡、铜绿、枯草、葡、铜绿、枯草、生孢各生孢各2 2支，另支，另一支不接种做空一支不接种做空白对照，培养白对照，培养3 3天天改良马丁培养基改良马丁培养基（9mL） 5 5支支：分别接种小于分别接种小于100cfu100cfu的白念、的白念、黑曲霉各黑曲霉各2 2支，支，另另1 1支不接种做支不接种做空白对照，培养空白对照，培养5 5天天逐日观察结果：逐日观察结果：空白对照管应空白对照管应无菌生长，若无菌生长，若加菌的培养基加菌的培养基管

16、均生长良好，管均生长良好，则灵敏度符合则灵敏度符合规定。规定。42 培养基的适用性检查 对起始样品进行连续对起始样品进行连续1010倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基获得单菌落。培养基表面菌落为圆形表面菌落为圆形，而培养基，而培养基内部菌落呈豆状内部菌落呈豆状或透镜状。或透镜状。43 培养基的适用性检查44 无菌检验有两种方法：直接接种法、薄膜过滤法 直接接种法:将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。 薄膜过滤法:含抗菌、

17、抑菌成分的供试品会抑制某些微生物的生长繁殖,所以用常规方法检查会出现假阴性的结果, 但并不等于产品中没有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜过滤法来去除供试品中可溶的抑菌性成分,把细菌等微生物截留在滤膜上,然后再经过处理培养使所含微生物生长繁殖, 从而使微生物检出。方法验证试验45 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。方法验证试验46 菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌（Escherichia coli）C

18、MCC(B) 4 4102外，金黄色葡萄球菌 、 枯草芽孢杆菌 、 生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。 方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。方法验证试验47 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3天 5天。各试验菌同法操作。方法验证试验：薄膜过滤法48方法验证所用菌种方法验证所用菌种（药典（药

19、典20102010版规定）版规定）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠埃希大肠埃希菌菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉分别接种各分别接种各菌种新鲜培菌种新鲜培养物至相应养物至相应培养基中培培养基中培养，将培养养，将培养物用物用0.9%0.9%无无菌氯化钠溶菌氯化钠溶液制成菌悬液制成菌悬液（浓度小液（浓度小于于100cfu/mL100cfu/mL）硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基8 8支：支：分别接种小于分别接种小于100cfu100cfu的金的金葡、大肠、枯草、生孢各葡、大肠、枯草、生孢各2 2支，其中支，其中1 1管接入每支培养管接入每支培养基规定

20、的供试品接种量，基规定的供试品接种量，另另1 1管作为对照，培养管作为对照，培养3 3天。天。改良马丁培养基改良马丁培养基4支支：分：分别接种小于别接种小于100cfu100cfu的白念、的白念、黑曲霉各黑曲霉各2 2支，其中支，其中1 1管接管接入每支培养基规定的供试入每支培养基规定的供试品接种量，另品接种量，另1 1管作为对管作为对照，培养照，培养5 5天。天。方法验证试验：直接接种法方法验证试验：直接接种法49 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的

21、任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。 方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。 方法验证试验：结果判断50 供试品数量的选择： 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1 支（或瓶）作阳性对照用。供试品的无菌检查51 检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两

22、份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。供试品的无菌检查52 供试品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。进入无菌检验室的样品若有两层（或两层以上）包装的，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。 操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。供试品的无菌检查53 供试品的无菌检查 在100级超净台内，酒精灯火焰周围，以无菌操作法将规定量的供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养基（不少于15ml/管）和改良马丁培养基（不少于10ml/管）的容器中。

23、 正确的无菌操作，既不能引入外来菌污染培养物造成假阳性，也要注意接触供试品的试验用具温度不可过高以免将可能存在的菌烫死。54阴性对照（目的是验证试验是否存在污染） ：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。阳性对照（目的是验证试验可靠性，防止假阴性）：应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养(48 72)小时应生长良好。供试品的无菌检查55无菌检查法-直接接种法供试品数量：同一批号3个 1

24、1个单位供试品 优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如：棉签、导尿包中的导尿管、注射器中的液体等56无菌检查法 直接接种法不适宜直接投放的可制备供试液：浸提介质：9g/L无菌氯化钠溶液（生理盐水）、0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 、根据供试品的特性，可选用其他验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。管类器具： 按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量约为10mL/min。容器类器具： 已有液体的直接取液；空容器每10cm2加入浸提介质1mL，振摇数次。实体类器具：表面积每10cm2加入浸提介质1mL，振摇数次。 供试液制备应按无菌操作法

25、进行，在制备后2h内使用。57无菌检查法 直接接种法 直接接种法：每个供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15mL，改良马丁培养基每管装量不少于10mL。 58无菌检查法-薄膜过滤法 2010年版中国药典规定:只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。 在蠕动泵的作用下，被测产品通过装有带空气过滤器的针头及无菌管路直接从样品容器中进入滤筒中，免去了通常膜转移过程中易产生的污染。

26、 无菌检查法中薄膜过滤法所用的滤膜孔径应不大于0.45m，直径约为50mm。59水溶液供试品水溶液供试品取规定量的供试液，直接过滤，或混合至含适量取规定量的供试液，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为每张滤膜每次冲洗量为100ml100ml，总冲洗量不得超过，总冲洗量不得超过1000mL1000mL，以免滤膜上微生物受损伤。，以免滤膜上微生物受损伤。无菌检查法-薄膜过滤法冲洗后分别将冲洗后分别将100mL100mL硫乙醇酸盐流体

27、培养基及改良硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内，培养。马丁培养基加入相应的滤筒内，培养。60无菌检查法 培养及观察 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。61 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分

28、证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。 阳性对照管应生长良好，阴性对照不得有菌生长。否则，试验无效。无菌检查法 结果判断62 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：果无效： （1 1）无菌检查试验所用的设备及环境的微）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；生物监控结果不符合无菌检查法的要求； （2 2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。微

29、生物污染的因素。 （3 3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。操作技术不当引起的。无菌检查法 结果判断63 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。 无菌检查法 结果判断64医疗器械无菌试验检查要点指南（2010版） 由于无菌检验时间跨度较长，因此过程的记录应能够完整体现试验的全过程，对于在试验过程中出现的各种情况，均应在记录中客观反映。65直接接种法试验结果 66薄膜过滤法试

30、验结果 67无菌检查法 判定6869试验报告中宜给出下列信息：试验报告中宜给出下列信息： 供试品名称；供试品名称； 生产批号和（或）灭菌批号；生产批号和（或）灭菌批号； 供试液制备方法；供试液制备方法； 接种方式；接种方式； 每日观察结果每日观察结果（包括阴、阳性对照）（包括阴、阳性对照）； 结果判定结果判定试验报告70（1 1）培养基配制记录）培养基配制记录（2 2）灭菌器、天平等仪器的使用记录）灭菌器、天平等仪器的使用记录（3 3）培养基无菌性检查、灵敏度检查记录）培养基无菌性检查、灵敏度检查记录（4 4）菌种购买、传代、使用记录）菌种购买、传代、使用记录（5 5）方法学验证记录）方法学验

31、证记录（6 6）无菌试验记录）无菌试验记录（7 7）灭菌物品制作）灭菌物品制作（8 8）废弃物处理记录）废弃物处理记录（9 9）洁净间监测记录）洁净间监测记录医疗器械无菌检验应有记录医疗器械无菌检验应有记录 71一、适用范围一、适用范围 二、检查内容二、检查内容1.选择的无菌检验方法选择的无菌检验方法 2.检验人员检验人员 资质资质3.现场察看无菌实验室环境现场察看无菌实验室环境4.设备和器具设备和器具 5.管理制度、操作规程等相关技术文件管理制度、操作规程等相关技术文件 6. 查阅试验记录查阅试验记录 三、其它应注意的问题三、其它应注意的问题 医疗器械无菌试验检查要点指南（医疗器械无菌试验检

32、查要点指南（20102010版）版） （1 1）培养基制备）培养基制备 （2 2）供试品的无菌检查）供试品的无菌检查 （3 3）培养及观察）培养及观察 （4 4）结果判断）结果判断（1 1）样品记录）样品记录 （2 2）灭菌物品制作记录）灭菌物品制作记录 （3 3）原始试验记录）原始试验记录 （4 4）废弃物处理记录）废弃物处理记录72医疗器械无菌试验检查要点指南（2010版）其它应注意的问题还包括： 生产企业应确保样品具有代表性：试验样品应从常规产品中能够代表加工过程和条件的批中选择。选择样品是随机的。试验样品的选择和处理技术应明确，以免对样品上所含的微生物的数量和种类造成污染和改变。试验样

33、品可以选择制造过程中的不合格产品，它们应该代表这个生产批的加工程序和条件。用于试验的不合格产品应不会影响无菌测试的有效性。73医疗器械无菌试验检查要点指南（2010版）其它应注意的问题还包括： 生产企业对于供试品的选取、转移过程要采取防止污染措施，确保试验结果的可靠性。选取制作供试品的试验样品时，样品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。进入无菌检验室的样品若有两层（或两层以上）包装的，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。 74无菌试验要点无菌试验要点器具灭菌：所有器具高压灭菌12130min，硫乙醇酸盐流体培养基: 接种前, 培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，3

34、0 35培养14天。改良马丁培养基： 23 28培养14天。两种培养基要符合无菌性检查及灵敏度检查的要求；75无菌试验要点无菌试验要点 供试品包装完好。培养基、供试品消毒后带入无菌室。采用验证过检查方法（直接接种法或薄膜过滤法）在洁净度10 000级下的局部100级区域内，以无菌操作法将规定量的供试品或供试液分别接种至两种培养基中，同时做阴性对照和阳性对照；按规定的温度培养14天。逐日观察并记录。如在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片

35、，染色，镜检，判断是否有菌。76无菌试验要点无菌试验要点 阳性对照管应生长良好，阴性对照不得有菌生长。供试品管均应澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。 出具试验结果后，所有培养物121高压灭菌30分钟处理。 做好相应试验记录。77实例：薄膜过滤法实例：薄膜过滤法考察冲洗量考察冲洗量 试验菌： (1)生孢梭菌64941 (2)铜绿假单胞菌10104 (3)枯草芽孢杆菌 63501 (4) 金黄色葡萄球菌26003总取样量：15g / 每株试验菌7879801.1.

36、红霉素对红霉素对生孢梭菌生孢梭菌生长无抑制作用生长无抑制作用. .2.2.红霉素对红霉素对铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌生长无抑制生长无抑制作用作用. .81821.红霉素对枯草芽孢杆菌有抑制作用.每筒加样量5g(相当于红霉素25mg)。2. 冲洗液体积400ml,枯草芽孢杆菌48小时后可见微弱生长,72小时生长良好。3. 在该检验条件下,冲洗400ml,三天内可检出枯草芽孢杆菌.8384851.1.红霉素对金黄色葡萄球菌有抑制红霉素对金黄色葡萄球菌有抑制作用。作用。2.2.在该检验条件下在该检验条件下, ,冲洗冲洗700ml,700ml,残留残留的红霉素不影响金黄色葡萄球菌的红霉素不影响金黄色葡萄

37、球菌的生长。的生长。86医疗器械初始污染菌检验技术医疗器械初始污染菌检验技术87GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准初始污染菌初始污染菌的检验 初始污染菌：产品消毒、灭菌前的细菌总数，可判明检品受细菌污染的程度以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对检品进行卫生学评价的综合依据。88 GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准 初始污染菌：产品消毒、灭菌前的细菌总数，可判明检品受细菌污染的程度以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对检品进行卫生学评价的综合依据。 微生物限度检查法：检查非规定灭菌产品受微生物污

38、染程度的方法。 消毒与灭菌的区别:消毒是杀灭清除传播媒介上病原微生物。但不能杀死芽孢等全部微生物。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。初始污染菌初始污染菌的检验 89 初始污染菌初始污染菌的检验 90部分一次性使用卫生产品微生物学指标要求部分一次性使用卫生产品微生物学指标要求产品种类产品种类微生物指标微生物指标初始污染菌初始污染菌cfu/g细菌菌落总数细菌菌落总数cfu/g或或cfu/mL大肠菌群大肠菌群致病性致病性化脓菌化脓菌真菌菌落总数真菌菌落总数cfu/g或或cfu/mL口罩口罩 普通级普通级 消毒级消毒级10 00020020不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检

39、出100不得检出不得检出尿布等尿布等 普通级普通级 消毒级消毒级10 00020020不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出100不得检出不得检出注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。91初始污染菌初始污染菌的检验准备：平皿洗净、烘干；牛皮纸包好灭菌 营养琼脂培养基配制、灭菌。步骤：采样，供试液制备，培养，菌落计数 在100级净化条件下用无菌方法打开至少3个包装； 从每个包装中取样，准确称取10g1g样品；剪碎后加入200mL无菌生理盐水中，充分混匀。 液体产品用原液直接做样液。92初始污染

40、菌初始污染菌的检验取上清液共取上清液共接种接种5 5个平皿，个平皿，每个平皿中每个平皿中加入加入1mL1mL供试供试液液用冷却至用冷却至4545左右左右的熔化的营养琼脂的熔化的营养琼脂培养基（培养基（15 15 2020）mLmL，倒入每个平皿，倒入每个平皿内混合均匀。内混合均匀。待琼脂凝固后翻待琼脂凝固后翻转平皿置转平皿置35 35 2 2 培养培养48h48h后，计算平后，计算平板上的菌落数。板上的菌落数。稀释度稀释度 5细菌菌落总数细菌菌落总数=5块平板上的细菌菌落总数块平板上的细菌菌落总数（cfu/g或或cfu/mL）如：取如：取10g10g样品入样品入200mL200mL生理盐水中，

41、则稀释生理盐水中，则稀释2020倍倍当菌落数在当菌落数在100100以内，按实有数报告，大于以内，按实有数报告，大于100100时采用二位有效数字时采用二位有效数字。93初始污染菌初始污染菌的检验计数方法：计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。菌落特征：菌落特征： 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色。淡

42、黄色。 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。或扁平。 大小差异很大。大小差异很大。94初始污染菌初始污染菌的检验 如果样品菌落总数超过本标准的规定，应将留存的复检样品依前法复测2次， 2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样品合格；其中有任何一次结果平均值超过本标准的规定，则判定被检样品不合格。95大肠菌群检测方法样液样液5mL接种至接种至50mL乳糖胆盐发酵乳糖胆盐发酵管，管， 置置35 2 培养培养24h，如不产酸，如不产酸产气，则大肠菌群产气，则大肠菌群为阴性。为阴性。如产酸产气，则划如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼线

43、接种伊红美蓝琼脂平板，置脂平板，置35 2 培养培养1824h，观察平板，观察平板上菌落形态。上菌落形态。取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏染色镜检，同时接种染色镜检，同时接种乳糖发酵管，置乳糖发酵管，置35 2 培养培养24h，观察产气情况。观察产气情况。 凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。芽孢杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。96 乳糖胆盐培养基中用的是溴甲酚紫作指示剂，该指示剂中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，大肠杆菌能分解乳糖产酸产气，因此培养基变成黄