感受态细胞和质粒DNA的转化C学习教案

1、会计学1感受态细胞感受态细胞(xbo)和质粒和质粒DNA的转化的转化C第一页，共40页。导入大肠杆菌导入大肠杆菌(d chn n jn): 氯化钙转化法氯化钙转化法electroporation 电击法又叫电穿孔法电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法体外包装感染法重组重组DNA导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞: DNA- 磷酸钙共沉淀、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法脂质体介导法、脂质体介导法、原生质体融合法原生质体融合法 酵母菌转化法酵母菌转化法: 完整细胞转化法完整细胞转化法 原生质体转化法原生质体转化法 电击法电击法第1页/共39页第二页，共40页。第2页/共39页第三页，

2、共40页。第3页/共39页第四页，共40页。 大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，培养基中，4可保存几个可保存几个(j )月，而有些菌株在相同条件下月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌株比大肠杆菌X1776株保存期长。株保存期长。 所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。

3、根据不同需要做短期、中期或长期保存。根据不同需要做短期、中期或长期保存。2. 菌株的保存菌株的保存(bocn)第4页/共39页第五页，共40页。 LB琼脂平板划线，琼脂平板划线，37，倒置平板培养，倒置平板培养(piyng)(16-24hr)，形成单一菌，形成单一菌落后，用石腊纸落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严将平皿四周封严(使平皿隔绝空气使平皿隔绝空气)，倒置放入，倒置放入4或或-20冰箱中，可保存数周。冰箱中，可保存数周。 E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养(piyng)基中，基中，4能能存活几个月。有些菌株只能活几天

4、。存活几个月。有些菌株只能活几天。 穿刺琼脂穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。，室温，避光可保存数年。 冰冻：单一菌落，液体培养冰冻：单一菌落，液体培养(piyng)基中扩增后，稀释后倒入基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘甘油培养油培养(piyng)基中，分装，置基中，分装，置-20 -70。可经过。可经过30次冻融，细菌仍然存次冻融，细菌仍然存活。活。 菌菌LB中过液培养中过液培养(piyng)，加入等体积，加入等体积2冰冻培养冰冻培养(piyng)基。液氮速基。液氮速冻后置冻后置-70，可经，可经15次冻融，保存次冻融，保存5年以上。年以上。具体具体(jt)保存方保存

5、方法：法：第5页/共39页第六页，共40页。琼脂穿刺培养基琼脂穿刺培养基 2冰冻培养基冰冻培养基 琼脂（琼脂（Difco） 6g K2HPO4 12.6g细菌胰蛋白胨细菌胰蛋白胨（Difco） 10gN+-柠檬酸柠檬酸 0.19g NaCl 8gMgSO4H2O 0.18g HCl 20mg(NH4)2SO4 1.8g ddH2O 至至1LKH2PO4 3.6g 甘油甘油 88g dH2O 至至1L 菌株保存菌株保存(bocn)液的配液的配制制第6页/共39页第七页，共40页。第7页/共39页第八页，共40页。抗生素抗生素工作浓度工作浓度 松驰型质粒松驰型质粒 严紧型质粒严紧型质粒 氨苄青霉素

6、氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水）（水） 60ug/mL20ug/mL 氯霉素氯霉素(Cm) 34mg/mL（乙醇）（乙醇）170ug/mL 25ug/mL 卡那霉素卡那霉素(Kan) 50ug/mL（水）（水）50ug/mL10ug/mL 链霉素链霉素(Sm) 10mg/mL（水）（水）50ug/mL10ug/mL 四环素四环素(Tc) 5mg/mL（乙醇）（乙醇） 50ug/mL10ug/mL抗生素的配制抗生素的配制(pizh)第8页/共39页第九页，共40页。大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞(xbo)制备和贮存制备和贮存 在基因工程研究过程中，常常需要将外源在基因工程研究过程

7、中，常常需要将外源DNADNA与载体与载体DNADNA连接连接，重组后，导入大肠杆菌，重组后，导入大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)受体细胞中，进行受体细胞中，进行DNADNA复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNADNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌(d (d chn n jn)chn n jn)宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNADNA转化大肠杆菌转化大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)但都没有成功。因此长期以来人们但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌一直认为大

8、肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)缺乏天然的转化机理。缺乏天然的转化机理。19701970年年M. Mandela M. Mandela 和和A. HigaA. Higa提出，在转化提出，在转化DNADNA之前，预先用氯化钙溶之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌液处理大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)，能够人为地诱导这些大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组而提高重组DNADNA转化入大肠杆菌转化入大肠杆菌(d ch

9、n n jn)(d chn n jn)的转化频率。的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。目前对这种机制尚不清楚。 第9页/共39页第十页，共40页。感受态细胞感受态细胞(Compenent cells)：将质粒：将质粒DNA或重组或重组(zhn z)质粒质粒DNA转化到转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。的状态。(主要介绍用氯主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法) 取出大肠杆菌取出大肠杆菌HB101菌种管划菌种管划LB琼脂平板，琼脂平板，-70保存，保存，37过过夜

10、夜(一般一般16小时小时)。 取一个菌落接种于取一个菌落接种于35mlLB培养管中，培养管中，37振振 培养，过夜培养，过夜(816小时小时)。 取出取出1mL过液菌加入新鲜配制的过液菌加入新鲜配制的LB培养液培养液50mL中中(2%接种量接种量)。37振荡振荡(zhndng)培养，培养，24小时。测定光密度值小时。测定光密度值(约约5107个细胞个细胞/mL)，OD550达。达。注意：不同的大肠杆菌菌株，每注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。间关系不同。 HB101，（约，（约107个细胞个细胞/mL） X1776，（约，（约1

11、07个细胞个细胞/mL）第10页/共39页第十一页，共40页。 细菌培养管取出置水浴中，细菌培养管取出置水浴中，10151015分钟。分钟。 细菌移入预冷的离心管中，细菌移入预冷的离心管中，44000GSA44000GSA转头，转离心转头，转离心5 5分钟；弃上清，留沉淀分钟；弃上清，留沉淀置于冰浴中。置于冰浴中。 加加2(2(预冷预冷) )溶液溶液25mL25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中，将沉淀充分悬浮，置冰浴中20302030分钟。延长分钟。延长CaCl2CaCl2处理处理时间时间(shjin)(shjin)，可增加感受态，所以也可在，可增加感受态，所以也可在00过夜。过夜。 4 4，4

12、0002500rpm40002500rpm转离心转离心5 5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。 用预冷的用预冷的2 2溶液，小心轻轻悬浮沉淀，溶液，小心轻轻悬浮沉淀，44过夜。可直接使用。过夜。可直接使用。 次日加次日加20%(20%(最终浓度最终浓度) )灭菌预冷甘油。灭菌预冷甘油。 分装成每分装成每EppendorfEppendorf管管200uL200uL。 新鲜新鲜(xn xin)感受态细胞用于质粒感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜转化最好。但新鲜(xn xin)感受态细胞感受态细胞0 4贮存不超过贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在天。长期保存，

13、必须将细胞在-70干冰或液氮气体部分速冻干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于分钟，再置于-80冰箱中保存，一般可保存冰箱中保存，一般可保存1年。年。第11页/共39页第十二页，共40页。 CaCl2处理处理4，低渗，低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局处理使细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称“打孔打孔”，使，使DNA分子能够进入分子能够进入(jnr)细细胞内。胞内。 CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使的酶位点，使DNA分分子能进入子能进入(jn

14、r)细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小数，只有感受态的细细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来胞才能稳定的摄取外来DNA分子。保持感受态的时间约分子。保持感受态的时间约12天，一般出现在生天，一般出现在生长对数期的后期。长对数期的后期。两种假设两种假设(jish)：第12页/共39页第十三页，共40页。5 . DNA转化转化(zhunhu)感受态感受态细胞细胞 抗生素抗生素 抽滤除菌并均置抽滤除菌并均置 -20保存。保存。抗生素不耐热，在加入到琼脂抗生素不耐热，在加入到琼脂板中时，应等琼脂冷至板中时，应等琼脂冷至4850时再加入抗生素时再加入抗生素 M

15、g+是四环素拮抗物，是四环素拮抗物， 需加需加MgCl2时改加时改加NaCl(6g/L) 四环素光敏感应避光保存四环素光敏感应避光保存（1）抗性琼脂）抗性琼脂(qingzh)板中抗生素板中抗生素的配制的配制第13页/共39页第十四页，共40页。 感受态细胞新鲜配制的或从感受态细胞新鲜配制的或从-80冻存取出后置于冰水中融化。冻存取出后置于冰水中融化。 取出分装到取出分装到Eppendorf管中，每管管中，每管100200uL。 加入需转化的加入需转化的DNA溶液溶液25ul充分混匀充分混匀(15ug/mLDNA)。 冰水中放置冰水中放置(fngzh)30分钟。分钟。 37或或42水浴水浴2分钟

16、。分钟。(热休克热休克) 冰浴冰浴2min。 每管再加入每管再加入1mL LB培养基，培养基，37振荡培养振荡培养1小时。小时。 取出后稍加离心，去掉部分上清，留取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或或250mLLB则全部铺板。则全部铺板。（2） 转化转化(zhunhu)步骤步骤第14页/共39页第十五页，共40页。 取取100200uL，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；静置静置510分钟。分钟。 倒置倒置37培养培养1218小时小时(一般过夜一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增，提取；次日，挑选单菌落，扩增，提取DNA

17、酶切，电泳检测，筛选重组子。酶切，电泳检测，筛选重组子。 并设下列对照：并设下列对照：A不加需转化的不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。培养基代替）。B用普通用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。 DNA超螺旋转化最好超螺旋转化最好(zu ho) DNA环状环状 次之次之 DNA线状线状 有干扰作用有干扰作用 1ug pBR322DNA转化入转化入HB101可得：可得：5106/2107转化子。转化子。 DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高限为，最高限为1

18、5kb。一般。一般1ug DNA可得可得51071108个转化菌。个转化菌。第15页/共39页第十六页，共40页。（3）注意事项）注意事项 宿主菌取出时应注意菌株名及编号。宿主菌取出时应注意菌株名及编号。 检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。 整个操作过程应保持无菌状态。整个操作过程应保持无菌状态。 LB培养液中不能有抗生素。培养液中不能有抗生素。 不同受体菌，培养要求不同。如不同受体菌，培养要求不同。如 K802株，株，OD550=0.5 最好最好(zu ho)，而，而X1776株，株，OD550最好最好(zu ho)。 质粒的质粒的DNA比较小，

19、有助于其转于宿主细胞中的效率。比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，转化率时，转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。第16页/共39页第十七页，共40页。（4）质粒的三种）质粒的三种(sn zhn)构型构型 超螺旋闭合超螺旋闭合(b h)环状环状DNA，cccDNA。 开环开环DNA，至少一股，至少一股DNA上有缺口，一处或多上有缺口，一处或多处使处使DNA鲜旋。鲜旋。 线状线状DNA 琼脂糖琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的电泳可将这三种构型的DNA

20、分分开，开，Agrose电泳中电泳中 cccDNA位置最前。位置最前。第17页/共39页第十八页，共40页。二、阅读二、阅读(yud)微生物的基微生物的基因型符号因型符号 在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。性。 1由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个品系的基因型时只

21、给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和和metA，是表示它的，是表示它的trp、his和和metA基因基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因因 (如如trp) 时，可以用时，可以用trp+，或者

22、，或者(huzh)只是简单地用只是简单地用“+”表示它的野生型品系，表示它的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作而不必在每次提到它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用表示，如。有些突变型是缺失突变，就用表示，如lon表示表示lon基因的缺失突变。基因的缺失突变。第18页/共39页第十九页，共40页。 2有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因子子F。细菌中有。细菌中有F因子的描述为因子的描述为F+；没有的为；没有的为F-。有些。有些F因子上面带有细菌因子上面带有细菌的某些基因，这样的的某些基因，这样的F因子写

23、作因子写作F，它所带基因的描述方法同上。例如，它所带基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示表示F因子上面带有细菌的因子上面带有细菌的lac和和proA，B基因。又如，基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示表示F因子上面带有因子上面带有lac和和proA，B基因，但是，其中的基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。基因是突变的基因。 3校正基因校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现型则应该，表现型则

24、应该写为写为Sup-。可是，带有。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写为基因的突变型品系的基因型必需写为sup-或者或者sup，它的表现型是，它的表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别(tbi)小心，以免搞错。此外，小心，以免搞错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示，如在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示，如Sul；但是，它；但是，它的基因型却用字母来表示的基因型却用字母来表示supD。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野

25、生。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野生型型(Su-)的品系干脆不用任何符号，只标出突变型品系的品系干脆不用任何符号，只标出突变型品系(Su+)的特殊基因座的特殊基因座位符号，如位符号，如supD和和supE等。等。 第19页/共39页第二十页，共40页。 JM83，F-，ara，(lac-proAB)，rpsL，80d，lacZ M15是这样一个品系：不带是这样一个品系：不带F因子，因子，ara基因座突变基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖因此不能代谢阿拉伯糖)，lac操纵子缺失操纵子缺失(因此不能利用乳糖因此不能利用乳糖)，30S核糖体的核糖体的S12亚基突变亚基突变(因此有链霉素抗生因此有链

26、霉素抗生)，-D-半乳糖苷酶基因部分缺失半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含因此在含X-gal的平板中有的平板中有-互补作用。如果将克隆的互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组质粒的重组DNA转化入这个细菌，就转化入这个细菌，就可以通过蓝可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子白菌斑来筛选出转化子)。 野生的大肠杆菌具有大约野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的的DNA分子，上面有约分子，上面有约2800个基因。当这些基因个基因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化中有突然变异发生时，基因产物随之变化(binhu)，并且有可能给大肠杆菌带来可以观，并且有可能给大肠杆菌带来可以观察到的变化察到的变

27、化(binhu)。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，而，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。试举一例来说明试举一例来说明(shumng)上述概念：上述概念：第20页/共39页第二十一页，共40页。 通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表现型发生变化时才被表示。但是现型发生变化时才被表示。但是(dnsh)需要特别的表示时，则在野生的基因型需要特别的表示时，则在野生的基因型上加上加“

28、+”，在变异的基因型上加，在变异的基因型上加“-”以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示名称的三个斜体字素表示(如如 DNA Aednine methylase-dam)。如果不同的基因变。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个大写字母导致相同的作用结果，则加上一个大写字母(如如Recombination- recA、recB、recC)。 某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“”表示，如表示，如“从从lac到到proAB基因缺失时表示为基因缺失时表示为(lac-proA

29、B)。 野生的大肠杆菌本来还有具有野生的大肠杆菌本来还有具有F因子等的质粒因子等的质粒DNA，并且感染噬菌体。把被，并且感染噬菌体。把被野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体(Prophage)，例如，例如 e14。一般当这。一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“()”或或“/”等加以区别表示。等加以区别表示。第21页/共39页第二十二页，共40页。表现型是用罗马字母体表示表现型是用罗马字母体表示(第一个字母大写第一个字母大写(dxi)。一般通过变。一般通过变异而获得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用异而获

30、得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用“+”表示表示(Steptomycin抗性：抗性：Str+)；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，用用“-”表示表示(Ampicillin敏感性：敏感性：Amp-)。基因型表现容易混淆，使用时。基因型表现容易混淆，使用时注意。注意。 *基因工程中经常使用的大肠杆菌几乎都来自于基因工程中经常使用的大肠杆菌几乎都来自于K-12菌株，最近也常菌株，最近也常使用由使用由B株及株及C株来源的大肠杆菌。株来源的大肠杆菌。 *大肠杆菌大肠杆菌B株原来就为株原来就为lon-，另外，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因株不具

31、有琥柏抑制基因(Amber suppressor free)，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。此不在基因型中加以表示，要注意。第22页/共39页第二十三页，共40页。p supE (suppressor) 抑制抑制(yzh)基因基因p supE变异时，即使存在终止密码变异时，即使存在终止密码UAG，此处也会插入谷氨酰胺，此处也会插入谷氨酰胺 (Glutamine) ，从而可使蛋白质继续合成。，从而可使蛋白质继续合成。p supF (suppressor) 抑制抑制(yzh)基因基因p supF变异时，即使存在终止密码

32、子变异时，即使存在终止密码子UAG，此处也会插入酪氨酸，此处也会插入酪氨酸 (Tyrosine) ，从而可使蛋白质继续合成。，从而可使蛋白质继续合成。停止密码停止密码(m m)回复回复第23页/共39页第二十四页，共40页。p recA (recombination) 重组重组p 相同的相同的DNA重组活性缺失重组活性缺失p 由于导入由于导入DNA与宿主与宿主DNA的重组受到阻害，可以保的重组受到阻害，可以保持插入持插入DNA的稳定性。与的稳定性。与recA13宿主菌相比，宿主菌相比，recA1宿宿主菌能够使插入主菌能够使插入DNA稳定存在。稳定存在。p recB，C (recombinati

33、on) 重组重组p 内切核酸酶内切核酸酶V变异。变异。p 抑制重组并能影响放射线损伤的修复。抑制重组并能影响放射线损伤的修复。 p traD (transmissibility) 遗传稳定性遗传稳定性p 在质粒在质粒F因子内部，与大肠杆菌的结合有关。因子内部，与大肠杆菌的结合有关。p TraD变异后，变异后，F因子自身的传递因子自身的传递(chund)能力显著能力显著下降。下降。重组重组(zhn z)机能缺失机能缺失第24页/共39页第二十五页，共40页。p dam (DNA adenine methylase) DNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶p 宿主菌来源宿主菌来源(liyun)的腺嘌呤

34、甲化酶的腺嘌呤甲化酶 (GmATC) 缺失缺失p dcm (DNA cytsine methylase) DNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶p 宿主菌来源宿主菌来源(liyun)的胞嘧啶甲基化酶（的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失）缺失p hsdR (host specificity defective) 宿主特异性缺陷宿主特异性缺陷p 宿主菌来源宿主菌来源(liyun)的的I型限制酶型限制酶Ecok (或或EcoB) 的切断部位蛋白的切断部位蛋白变异变异p 转化的外源转化的外源DNA不被限制酶不被限制酶EcoK切断，可以进行克隆切断，可以进行克隆p hsdM (host specifici

35、ty defective) p 宿主菌来源宿主菌来源(liyun)的的I型限制酶型限制酶EcoK (或或EcoB) 的甲基化酶部位的甲基化酶部位蛋白变异蛋白变异p hsdS（host specificity defective）p 宿主菌来源宿主菌来源(liyun)的的I型限制酶型限制酶EcoK (或或EcoB) 的识别部位蛋白的识别部位蛋白变变异变变异p 转化的外源转化的外源DNA不被限制酶不被限制酶EocK切断，可以进行克隆切断，可以进行克隆对插入对插入(ch r)DNA具有直接作用因子的缺具有直接作用因子的缺失失第25页/共39页第二十六页，共40页。p endA (endonuclea

36、se) 内切核酸酶内切核酸酶p 宿主菌来源的非特异性内切核酸酶宿主菌来源的非特异性内切核酸酶I活性缺失活性缺失(qu sh)，可以可以 提高纯化的质粒提高纯化的质粒DNA的质量。的质量。p NcrA (methylcytsine restriction)p mCG序列的甲基化活性缺失序列的甲基化活性缺失(qu sh)。p mcrB，C (methylcytsine restriction)p GmC序列的甲基化活性缺失序列的甲基化活性缺失(qu sh)。p mrr (methylation requiring restricion)p mA以及以及mC序列的甲基化活性缺失序列的甲基化活性缺失(

37、qu sh)。第26页/共39页第二十七页，共40页。p rpsL (ribosomal protein small subunit)p 由由30S核糖体蛋白变异核糖体蛋白变异(biny)而获得链霉素而获得链霉素 (Steptomycine)抗性抗性 (Strr)。p gyrA (gyrase)p 由由DNA回旋酶亚基回旋酶亚基A的变异的变异(biny)而获得的萘啶酮酸而获得的萘啶酮酸(Nalidxic acid) 抗性抗性 (Nalr)。 p Tn5 (transposon)p 转座子变异转座子变异(biny)，获得卡那霉素，获得卡那霉素 (Kanamycine) 抗性抗性(Kmr)。p T

38、n10 (transposon)p 转座子变异转座子变异(biny)，获得四环素（，获得四环素（Tetracycline）抗性（）抗性（Tetr）。）。抗药性的变异抗药性的变异(biny)第27页/共39页第二十八页，共40页。p lon (long form)p 分解异型蛋白质的分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌失。大肠杆菌B株原来就为株原来就为lon-。可抑制其表达。可抑制其表达(biod)的融合蛋白质的分解。的融合蛋白质的分解。p omp (outer membrane protein) 外膜蛋白外膜蛋白p 膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达

39、膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达(biod)的融合蛋白质的分解。的融合蛋白质的分解。宿主宿主(szh)蛋白酶蛋白酶缺失缺失第28页/共39页第二十九页，共40页。p lac Iq (lactose)p 乳糖操纵子中控制乳糖操纵子中控制-半乳糖苷酶表达的调节蛋白基因。由于半乳糖苷酶表达的调节蛋白基因。由于(yuy)lacIq变异，表达调节蛋白过量形成，因此从乳糖启动子开始的变异，表达调节蛋白过量形成，因此从乳糖启动子开始的转录过程完全受到抑制。转录过程完全受到抑制。p lacZ (lactose)p -半乳糖苷酶活性缺失半乳糖苷酶活性缺失p lacZ M15p -半乳糖苷酶蛋白的半乳糖苷酶蛋

40、白的w-fragment得到表达。当与多数载体质粒中所得到表达。当与多数载体质粒中所具有的具有的-fragment共同存在时，可使共同存在时，可使-半乳糖苷酶的活性回复半乳糖苷酶的活性回复 (-互补互补性性)。在含有。在含有X-gal的平板培养基上，可以通过蓝白菌的差别选择重组的平板培养基上，可以通过蓝白菌的差别选择重组体。体。p deoRp deoR变异，可以选择性地改善大分子变异，可以选择性地改善大分子DNA的转化。的转化。有利于选择有利于选择(xunz)转化体的转化体的基因基因第29页/共39页第三十页，共40页。p dut (dUTPase) dUTP酶酶p dUTP分解酶活性缺失，当

41、分解酶活性缺失，当dUTP分解酶存在时，分解酶存在时， dUTP不能掺入到不能掺入到DNA链中。链中。p ung (Urasil-N-glycosylase) 尿嘧淀尿嘧淀-N-糖苷酶糖苷酶p 尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。糖苷酶活性缺失。p 当具有这种基因时，可以特异性地分解当具有这种基因时，可以特异性地分解DNA含含U的的那条链。那条链。p mutS (mutator) 突变子突变子p 未被甲基化的新合成未被甲基化的新合成(hchng)DNA链的错配序列修链的错配序列修复受到阻碍。复受到阻碍。有利于点突变有利于点突变(tbin)的基因的基因第30页/共39页第三十一页，共40页。p l

42、euB (leucine) 亮氨酸亮氨酸p 在最小培养基中必须添加亮氨酸在最小培养基中必须添加亮氨酸 (Leu)p proAB (proline) 脯氨酸脯氨酸p 脯氨酸代谢基因变异脯氨酸代谢基因变异(biny)。在最小培养基中只有添。在最小培养基中只有添加脯氨酸才能生长。用于确认加脯氨酸才能生长。用于确认JM109等大肠杆菌菌株的等大肠杆菌菌株的F因子是否脱落。因子是否脱落。p Thi-1 (thiamine) 硫胺素硫胺素p 硫胺素代谢基因变异硫胺素代谢基因变异(biny)，在最小培养基中必须添，在最小培养基中必须添加硫胺素。加硫胺素。菌株筛选菌株筛选(shixun)用基因用基因第31页/

43、共39页第三十二页，共40页。LacZ、lac5、trpE、bio、bio256从大肠杆菌从大肠杆菌lac、trp和和bio区置换而来区置换而来imm80、QSR80从从80噬体置换而来噬体置换而来imm434从从434噬菌体置换而来噬菌体置换而来imm21从从21噬菌体置而来噬菌体置而来int29从从29噬菌体置换而来噬菌体置换而来b2、b1007、b527、b189B域的缺失突变，使域的缺失突变，使att位点受破坏并因而阻止溶源化位点受破坏并因而阻止溶源化KH5280噬菌体噬菌体DNA的缺失突变的缺失突变KH53类似于类似于噬菌体噬菌体cI区域的区域的80噬菌体区域的缺失突变，可有效地防止

44、溶源化噬菌体区域的缺失突变，可有效地防止溶源化KH54RexcI区域的缺失突变，可有效地防止溶源化区域的缺失突变，可有效地防止溶源化nin5转录终止位点转录终止位点tR2的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于N基因产物，并基因产物，并且也删除了且也删除了ral基因附近的基因附近的BamH I位点位点ninL44转录终止位点转录终止位点tR2的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于N基因产物，并基因产物，并且也删除了且也删除了ral基因附近的基因附近的BamH I位点。位点。WL113从从33 240位的位的SalI到到34 50

45、0位的位的BamH I之间的之间的1，3kb缺失突变，不损伤缺失突变，不损伤gam基因，但基因，但kil，c、ssb和和ral基因被删除。基因被删除。sslI1-2从第一到第二个从第一到第二个SalI之间的之间的0.5kb缺失突变，缺失突变，gam基因和部分基因和部分bet基因被删除。基因被删除。第32页/共39页第三十三页，共40页。续续 上上 表表 shnd 2-3噬菌体第二与第三个噬菌体第二与第三个Hind 之间的之间的2.3kb缺失突变，部分缺失突变，部分b区被删除区被删除 sxI1oXbaI酶切后经外切核酸酶消化而造成的酶切后经外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突变缺失突变 鼠填充

46、片段鼠填充片段 大肠杆菌填充片段大肠杆菌填充片段 lac操纵基因操纵基因+ 腺病毒腺病毒DNA在重组体中将被置换的载体在重组体中将被置换的载体DNA片段片段 Bluescript M13-重组入重组入ZAP载体的噬菌粒，当用载体的噬菌粒，当用M13辅助噬菌体感染后，噬菌粒部分可在体内被切下。辅助噬菌体感染后，噬菌粒部分可在体内被切下。 lacY、lacZ、lacPO 、lacIq、ampr插入插入OPF8的的lac和氨苄青霉素抗生基因和氨苄青霉素抗生基因 Aam、Bam、Eam、 Wam、gamam可被可被supE和（或）和（或）supF抑制的琥珀突变。抑制的琥珀突变。 int amInt基因

47、内的基因内的BamH I位点被消除后形成的琥珀突变。位点被消除后形成的琥珀突变。 Sam7、Sam100参与溶解细菌细胞膜的一个基因内的琥珀突变。该突变可被参与溶解细菌细胞膜的一个基因内的琥珀突变。该突变可被supF抑制，但不被抑制，但不被supE抑制，失却野生型抑制，失却野生型S基基因产物后，引起感染性噬菌体颗粒在细胞内发生积累。因产物后，引起感染性噬菌体颗粒在细胞内发生积累。 cIts857使使cI基因产物对热不稳定的温度敏感突变基因产物对热不稳定的温度敏感突变 chi促进促进噬菌体定向重组的特定八核苷酸序列噬菌体定向重组的特定八核苷酸序列 gamGam基因编码大肠杆菌基因编码大肠杆菌re

48、cBC外切核酸酶的抑制物，因此可使外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型型DNA复制有效地转向滚环复制。复制有效地转向滚环复制。Gam基基因产物对于因产物对于噬菌体有噬菌体有recA-菌株（菌株（Fec表型）和表型）和P2噬菌体溶源的噬菌体溶源的recA+菌株（菌株（Spi表型）内的生长非常重要。表型）内的生长非常重要。 exo bet (red)Exo和和bet是位于是位于噬菌体噬菌体red区域的两个基因（区域的两个基因（red表示两个基因或任一个基因）。这两处基因产物参与当表示两个基因或任一个基因）。这两处基因产物参与当从从Q型型DNA复制向滚环复制转变时的重组过程。这两个基因产物对于复制向滚环

49、复制转变时的重组过程。这两个基因产物对于噬菌体在噬菌体在recA-菌株（菌株（Fec表型）和表型）和P2噬菌体溶源的噬菌体溶源的recA+菌株（菌株（Spi表型）内的生长非常重要。表型）内的生长非常重要。第33页/共39页第三十四页，共40页。常用细菌菌株常用细菌菌株 C600F-thi-1 thr leuB6 lacY1 ton21 supE44-常用于制备裂解物及增殖常用于制备裂解物及增殖gt10的抑制型菌的抑制型菌株株 该菌株也叫该菌株也叫CR34 C600: HflA150 (Y1073)F-thi-1 thr leuB6 lacY1 tonA21 supE44- hflA150(ch

50、r:Tn10)host for repressing background plaques of gt10 when establishing cDNA libraries DH5F-endA1 recA1 hsdR17(rk-mk+)deoR thi-1 supE44-gyrA96 relA1host for pBR322 or other non-Puc vectorsuseful for cDNA cloning DH5F-80dlacZM15(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44-gyrA96relA

51、1host for pUC and other - complementation vectors;pBR322useful for cDNA cloning DH5FF-80dlacZ(lacZYA-argF)U169 endA1 hsdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44-gryA96relA1Host for growth of M13, phagemids, or other male-specific bacteriophageprovides -complementation for M13mp vectors第34页/共39页第三十五页，共40页。续续 上上

52、 表表 DH5F IQFproAB+lacIqZM15zzf:Tn5Kmr/ 80dlacZM15(lacZYA-ARGf)U169 andA1 recA1hsdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44-gyrA96 relA1host ofr expression from the lac promotherhost for growth of M13, phagemids, or other male-specific bacteriophageprovides -complementation for M13mp vectors DH5- MCRF-mcrA(mrr-h

53、sdRMS-mcrBC)80dlacZM15(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 deoR thi-1supE44-gyrA96 relA1host for pUC and other - complementation vectors;pBR322useful for generating genomic libraries containing methylated cytosine or adenine residues DH10BF-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15lacX74 endA1recA1 deoR (ara,leu)76

54、97araD139 galU galK nupG rpsL-host for pUC and other - complementation vectors;pBR322useful for generating genomic libraries containing methylated cytosine or adenine residuesusful for plasmid rescue procedures DH10BACF-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15lacX74 endA1recA1 deoR (ara,leu)7697araD139 galU

55、 galK nupG rpsL-/bmon14272/Pmon7124host for pEASTtBAC vectorsuseful for generating recombinant bacmid DNA for use in BEVS technology第35页/共39页第三十六页，共40页。续续 上上 表表 DH10B (ZIP)F-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15lacX74 endA1recA1 deoR (ara,leu)7697araD139 galU galK nupG rpsLxisb ind-pZIP1(P1 ori-kanr-cre)host for ZIPLox vectors to recover recombinant