苗木抗旱性生理实验方法

1、2试验方法2.1试验设计试验采用盆栽试验的方法，将苗木移栽入合适的花盆中，给予较好的管护。待苗木成活生长 稳定后开始试验。每个品种都设置对照株（给v充足水分）。试验组以时间为梯度 （0d,6d,12d,18d,24d,30d,36d）,采用自然干旱的办法,每隔6天对各项指标进行监测,同时监测 土壤中水分的变化。2.2指标及监测方法2. 2.1叶片水分状况（1）组织含水量的测定仪器和用具：电子天平（感量o.lmg）,烘箱，剪刀，100ml烧杯，铝盒，吸水纸试剂：剪取组织，迅速放入已知重量的铝盒中，称出鲜重（wf）；然后将组织浸入蒸憎水中6-8h, 収出用吸水纸擦干表面水分，称重，再将组织浸入蒸僧

2、水中lh,擦干称重，直至组织重量稳定恒 重，既得样品饱和鲜重（wt）；然后将组织连同铝盒放入己升温至105°c的烘箱中，杀青15min, 然后于80°c下烘至恒重，称出干重（wd）；组织含水量（占鲜重）=（wf-wd）100%/wf组织含水量（占干重）二（wf-wd）100%/wd相对含水量（rwc） = （wf- wd） 100%/ （wt- wd）水分饱和亏（wsd） =1-rwc（2）离体叶片保水力测定剪取各个品种各个处理叶片迅速将其插入蒸懈水中，饱和3小时以上，取出叶片，剪去叶柄， 称量叶片重量。然后将叶片悬于室内，在空气中缓慢脱水（记录室温和rh）,每隔两个小吋称

3、重 一次，称4次后，知道24小时再称重1次，将叶片在80°c下烘干称干重。根据所得数据计算出 每次称重时的叶片含水量，再以脱水时间对叶片相对含水率作图，可得叶片保水力的差异。2. 2. 2光合指标（1）叶绿素a、叶绿素b、叶绿素和类胡萝卜素含量的测定仪器和用具：分光光度计，研钵一套，剪刀，玻棒，25ml棕色容量瓶3个，小漏斗3个，直 径7cm定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平（o.olg感量）试剂：96%乙醇，石英砂，碳酸钙粉a取不同油茶吊种苗木的新鲜叶片，擦净表面剪碎（去掉屮脉），混匀。b称取剪碎的新鲜样品0.2g （共三份），放入研钵加入少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml96

4、%乙 醇研成匀浆，再加入乙醇10ml,继续研磨至组织变白，静置3-5minoc取滤纸一张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提収液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容 量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。d用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容暈瓶屮，直至滤纸和残渣屮无绿色为 止，最后用乙醇定容至25ml,摇匀。e把叶绿体色素提取液倒入比色杯，以96%乙醇为空白，在波长665、649、470nm下测定消 光度。ca二 13.95。6656.88。649cb=24.96d649732d665cx .c=（1000d47（）-2.05ca-ll 4.8cb） /

5、245叶绿素含量（mg/cn?）二叶绿素浓度x提取液总体积x稀释倍数/样品鲜重 叶绿素a含量（mg/cm2）二叶绿素浓度x提収液总体积x稀释倍数/样品鲜重叶绿素b含量（mg/cn?）二叶绿素浓度x提取液总体积x稀释倍数/样品鲜重类胡萝卜素含量（mg/cm2）二叶绿素浓度x提取液总体积x稀释倍数/样品鲜重（2）光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用效率的测定用lico-6400便携式光合测定分析仪（美国）进行光合测定，在不同处理的树冠中部向阳选収正 常生长的功能叶，测定叶片的净光合速率（pn）、蒸腾速率（tr）、气孔导度（gs）、胞间co?浓 度（ci）,并计算水分利用效率（wue） =pn/t

6、ro每个样品至少3次重复，结果取平均值。2. 2. 3生理生化指标（1）丙二醛的测定采用硫代巴比妥酸（tba）比色法测定。样品提取方法与酶夜提取相同。测定时向具塞试管 中加入2ml样品提取液和3ml 0.5%硫代巴比妥酸（tba）溶液（用5%乙酸溶液溶解定容），沸 水浴屮煮沸lomin后取出流水冷却，3000xg离心15min取上清液，以0.5%tba为空白调零，分 别在波长532nm, 600nm和450nm下测od值。结果按下式计算：丙二醛含量（nmol 才fw） =6.452x （d532-d6（x）-0.559xd450 x vxvtx/（wxvs） 式中，v：反应液总量，ml； vt

7、：提収液总体积，ml； vs：测定用提取液体积，ml； w：样品 鲜重，go（2）游离脯氨酸含量测定采用碱基水杨酸提取，苗三酮显色法测定。a制作标准曲线：取7支25ml具塞试管，编号，按下表2-2加入试剂：表2-2游离脯氨酸标准曲线溶液组成tab.2-2 solution compositin of standard curve of free proline试剂1234567脯氨酸标准液（loug/ml）00.20.40.81.21.62.0蒸馅水（ml）2.01.81.61.20.80.40冰醋酸（ml）2222222苗三酮（ml）2222222甲苯（ml）5555555脯氨酸含量（u g

8、）0248121620分别向各管准确加入脯氨酸标准液，再用蒸徭水将体积补至2ml,摇匀。再向各管中加入冰 酷酸和酸性即三酮各2ml。摇匀后，在沸水浴中加热显色30min,収出后冷却至室温，向各管加 入5ml甲苯，充分摇动，以萃取红色产物。萃取完后，避光静置4h以上。待完全分层后，用吸 管吸取甲苯层，用分光光度计在520nm波长下测定，以脯氨酸含虽为横坐标，吸光值为纵坐标, 绘制标准曲线。b磺基水杨酸提取：取各苗木的叶片，装入塑料袋中，迅速带回实验室。称取o.lg新鲜样品 放入具塞试管中，加入5ml3%的磺基水杨酸溶液，加盖，将试管浸入沸水浴中提収15min,过滤， 滤液待测。c测定：吸取滤液2

9、ml于试管内，与标准液浓度的脯氨酸系列溶液同法显色测定。计算：测 定结果按下式计算：游离脯氨酸含量（临g'fw） =cx（v/a）/w式中，c：从标准曲线上查得脯氨酸微克数；v：提取液总体积ml； a：测定时取用提取液 ml； w：样品鲜重g。（3）可溶性蛋白含量测定釆用考马斯亮蓝g-250法a制作标准曲线：取6支15ml具塞刻度试管编号，按下表2-3加入试剂。加完试剂后盖上 玻璃塞，将溶液混匀，放置2-3min后，在595nm波长下测定吸光度（注意应在lh内完成比色）。以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。b样品测定：取0.2g样品，加水研磨成匀浆后，定容于10ml

10、容量瓶中，取部分于5000x& 下离心lomin,准确吸収上清液o.lml,加入0.9ml水和5ml考马斯亮蓝g-250试剂，充分混合， 放置2-3min后在595nm波长下记录吸光值，在标准曲线上查得蛋白质含量。表2-3可溶性蛋口质标准曲线溶液组成tab.23 solution composition of standard curve of soluble protein试剂123456牛血清蛋白标准液（100 u g/ml）00.20.40.60.81.0水(ml)1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝g-250（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100c

11、结果计算：样品中可溶性蛋白质含量（mg gdfw） =cx（v/a）/（wx1000）式中，c：从标准曲线上查得样品测定管中含蛋白质的量（pg）； v：提収液总体积 5l）； a：测定时加样量（ml）； w：样品鲜重（g）； 1000：换算系数，1 mg=1000ug。（4）可溶性糖含量测定采用蔥酮比色法测定。a提取分离：取0.1g-0.2g样品，研磨，用8ml80%乙醇分4次洗入10ml离心管中，80°c水 浴中提取30min,其间摇动几次。3500xg离心10min,上清液转入25ml容量瓶中；再向沉淀中 加入5-6ml80%乙醇，如上法重复浸提2次，将上清液合并于25ml容量瓶

12、中，定容至刻度。b制作标准曲线取6支18x180ml试管编号，按下表24加入试剂：表2-4可溶性糖标准曲线溶液组成tab.2-4 solution compositon of standard curve of soluble sugar试剂123456葡萄糖标准液（100 u g/ml）00.20.40.60.81.0水（ml）2.01.81.61.41.21.0蔥酮-硫酸（ml）555555葡萄糖含量（ug）020406080100加完试剂在100°c水浴中准确加热10min后取出流水冷却，以1号管为空白调零，在620nm 波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，

13、绘制标准曲线。c样品屮可溶性糖含量的测定取上述测定还原糖剩余的样品液适当稀释后取2ml,再加入 5ml蔥酮硫酸，与标准管同样操作，记录620nm波长下的吸光度。结果计算：可溶性糖含量（mg g“fw） = cx（v/a） xn/（ wx1000）式中，c：从标准曲线上查得样品测定管中含衙萄糖的量（ug）； v：样品提取液总体积， ml； a：测定时取样体积，ml； w：样品鲜重，g； n：稀释倍数；1000：换算系数，1 mg=1000 ug。（5）保护酶活性的测定a酶液的制取称取0.5克鲜重叶片，加入1ml磷酸缓冲液，冰浴研磨，研磨后加入提収介质（磷酸缓冲液 ph=7.8, 0.05mol/

14、l）冲洗 23 次，定容至 10ml。低温（0-4°c）离心 20min,12000rpm,离心后上 清液即为粗酶提取液冷藏保存。b超氧化物歧化酶（sod）活性的测定表2-1 sod活性测定反应系统tab.2-1 reaction system of sod actibity assay试剂(ml)样品ck1ck250mmol/l磷酸缓冲液(ph7.8)1.51.51.5130mmol/l met 溶液0.3().30.3750 u mol/l nbt 溶液0.30.30.3looumol/l edta-na2 溶液0.30.30.320 u mol/l核黄素0.30.30.3粗酶液

15、000蒸馅水0.50.60.6氮蓝四畔(nbt)比色法，sod酶活性以抑制50%nbt反应为一个酶活性单位。按照表21加 入试剂后，混匀，ck1遮光，ck2不遮光，与其它各管同时置养箱中4000lux下照光30min,温 度25-35°co反应结束后，遮光终止反应。以ck1对照管为空白调零，在560nm波长下测定吸光 度。以抑制nbt光化还原的50%为一个酶活力单位(u),结果用ug'fwh"表示。sod 活性(u g'fw h") = (ao - as) xvtx60/ (0.5x a()x wx asxt)式中，ao：照光对照管光吸收值；as：

16、样品管的光吸收值；60： 60min换算；vt：提収液总 体积，ml； vs：测定用酶液体积，ml； w：样品鲜重，g； t：照光时间min。c pod活性的测定采用愈创木酚显色法，每隔30秒记录1次，以每分蚀内a470每下降0.1为一个活性单位。 3.0ml 反应体 0.2%愈创木酚 0.9ml, 0.3%h2o2 l.oml, 50mmol/l ph7.0 磷酸缓冲液 l.oml,酶液 0.1 ml,反应温度25°c。加入酶液后记录3min内波长470nm处每30s的吸光值变化，以od值 变化0.1为一个酶活力单位(u),结果用ugfw min"表示。结果计算按pod

17、活性(u gjfw mii?)=卜2必乂 (0.1 xwxvsxt)式中，a a47o： a470在0-3min的差值；vt：提取液总体积，ml； vs：测定体积，ml； w： 样品鲜重，g； t：酶反应时间，mimd cat活性的测定用紫外吸收法，以每分钟内a240每下降0为一个酶活力单位。3.0ml反应体系包括0.3% h2o21.0ml, 50mmol/l ph7.0磷酸l.oml,酶液o.lml。反应温度25°c。加入酶液后记录3min 内波240nm处每吸光值变化，以每分钟od值变化0.1为一个酶活力单位(u),结果用ug，f wmin"表示。结果计算按下式cat

18、 活性(u g'fw min") = a a24o x vt/ (0xwxvsxt)式中，aa240： a240在0-3min的差值；vt：提取液总体积，ml； vs：测定体积，ml； w： 样品鲜重，g； t：开始加h2o2到最后一次读数时间，min0(6) 膜通透性的测定仪器和用具：电导仪，真空泵(附真空干燥器)一套，恒温水浴器一具，水浴试管架一个, 具塞刻度试管，打孔器或双面刀片，10ml移液管，试管架，铝锅，电炉，铁子，剪刀，搪瓷盘, 记号笔，滤纸。塑料纱网(3cn?)试剂：去离子水a将处理组和对照组叶片用去离子水冲洗2次，再用洁净滤纸吸净表面水分，用6-8mm的打 孔器避开主脉打取叶圆片，每组叶片打取叶圆片30片，分别装在3支洁净的刻度试管中，每个 处理放10片。b在装有叶片的各管中加入10ml去离子水，并将大于试管口径的塑料纱网放入试管距离液 而lcm处，以防止叶圆片在抽气时翻出试管。然后将试管放入真空干燥器中用真空泵抽气10min