试比较原核和真核细胞的mRNA的异同

1、第一章绪论分子生物学 :从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复） 、基因的表达（转录和翻译）与调控。分子生物学研究内容 DNA重组技术（基因工程）1、可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽;2、可用于定向改造某些生物的基因组结构;3、可被用来进行基础研究 基因的表达调控1 信号转导研究;2 转录因子 ;3 研究 RAN 剪接 生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） 基因组、功能基因组与生物信息学研究第二章染色体和DNA 复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制在 D

2、NA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA 链为滞后链。DNA 的复制过程（大肠杆菌为例）双链的解开 ;DNA 的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。RNA 引物的合成 :DnaB 蛋白活化引物合成酶，引发RNAori(或引物的合成。o）、富含A、 T的区段引物长度约为几个至10 个核苷酸，DNA 链的延伸切除 RNA 引物，填补缺口，连接相邻的DNA 片段复制时，解链酶等先将DNA 的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复

3、制叉在 DNA 复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。复制的几种主要方式P421、双链环状、型复制、双向等速2、滚环型：单向复制的特殊方式如： 174的双链环状DNA 复制型（ RF)（ 1）模板链和新合成的链分开;（ 2）不需 RNA 引物，在正链 3 OH 上延伸（ 3）只有一个复制叉 ;3、 D 环复制真核生物中单向复制的特殊方式如：动物线粒体DNA 的复制特点DNA1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子（约2、复制叉移动的速度较慢（约50bp 秒），仅为原核生物的150bp 左右）；1 10。3、真核生物染色体

4、在全部复制完之前 ,各个起始点不再重新开始 DNA 复制；真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点4。、真核生物有多种DNA聚合酶。5、真核生物DNA 复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。（真核冈崎片段长约100-200bp ，原核冈崎片段长约 1000-2000bp 。原核和真核生物DNA 的复制特点比较复制起点（ ori ）：原核一个，真核多个；复制子：原核一个，真核多个；复制子长度：原核长；真核短；复制叉：原核多个；真核多个；复制移动速度：原核较快；真核较慢；真核生物染色体在全部完成复制前，各起始点的DNA 复制不能再开始。而在快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始新

5、的DNA 复制。原核生物染色体的复制与细胞分裂同步，可以多次复制；真核生物染色体的复制发生在S 期，是细胞分类的特定时期，而且仅此一次。DNA 修复系统错配修复碱基切除修复核甘酸切除修复功能恢复错配切除突变的碱基修复被破坏的DNADNA 直接修复SOS 系统修复嘧啶二体或甲基化DNA ， DNA的修复，导致变异第三章生物信息的传递（上）转录录 :生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程参与转录的物质原料 : NTP (ATP, UTP, GTP, CTP)模板 :DNA; 酶 : RNA 聚合酶 ;其他蛋白质因子RNA 合成方向： 5'3'与 mRNA 序列相同的那条 DN

6、A 链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA 合成的 DNA 链称为模板链。结构基因： DNA 分子上转录出 RNA 的区段，称为结构基因。转录单元（ transcription unit ）一段从启动子开始至终止子结束DNA 序列。RNA 聚合酶原核生物 RNA 聚合酶（大肠杆菌为例）全酶=核心酶 + 因子大肠杆菌 RNA 聚合酶的组成分析（看书）真核细胞的三种RNA 聚合酶特征比较（看书）RNA 聚合酶与 DNA 聚合酶的区别RNA 聚合酶DNA 聚合酶大小 (M)大， 4.8× 105dol小， 1.09× 105dol引物无有产物较短，游离较长，与模板以氢

7、键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无53， 35校对合成能力无有修复能力无有启动子定义：指能被RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA 序列。TATA 区：酶的紧密结合位点（富含AT 碱基，利于双链打开）TTGACA 区：提供了 RNA 聚合酶全酶识别的信号转录起点：与新生RNA 链第一个核甘酸相对应DNA 链上的碱基真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同真核生物启动子的结构：核心启动子（core promoter）和上游启动子元件（upstream promoter element ， UPE ）核心启动子：指保证RNA 聚合

8、酶转录正常起始所必需的、最少的DNA 序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游 TATA 区作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始上游启动子元件包括 CAAT 盒（ CCAAT ）和 GC 盒（ GGGCGG ）等（ CAAT ： -70 - -80bpGGGCGG ： -80 - -110bp)作用：控制转录起始频率。转录的基本过程： 1、起始位点的识别： RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程。 RNA 聚合酶全酶（ 2 )与模板结合2、转录起始RNA RNA 聚合酶全酶 (链上第一个核甘酸键的产生2)与模板结合DNA 双链解开在 RNA 聚合酶作用下发生第一次

9、聚合反应，形成转录起始复合物3、 RNA 链的延伸亚基脱落， RNA pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA 模板前移；在核心酶作用下，NTP 不断聚合， RNA 链不断延长。注意： 9 个核苷酸以前还在启动子区，容易脱落，一旦形成9 个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。4、转录终止终止子（ terminator ）：位于基因的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约真核生物终止 : 由一段特定序列5 AATAAA 3和回文序列（反向重复序列）组成。分为两类：6-20bp 。强终止子内部终止子：不依赖Rho ( )因子的终止。弱终止子需要 因子（ r

10、ho factor ），又称为 依赖性终止子（Rho-dependent terminator）1)当 RNA 链延伸到转录终止位点时，RNA 聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离， 转录泡瓦解， DNA恢复成双链状态，而RNA 聚合酶和RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。终止位点上游一般存在一个富含GC 碱基的二重对称区，RNA 形成发夹结构； 在终止位点前面有一段由4-8 个 A 组成的序列， RNA 的 3端为寡聚U 终止效率与二重对称序列和寡聚U 的长短有关，长度越长效率越高2)依赖 因子： 六聚体蛋白、 水解各种核甘三磷酸促使新生RNA 链从三元转录复

11、合物中解离出来，从而终止转录增强子（ P78） :概念：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的特点： 1.远距离效应；2.无方向性； 3.顺式调节；强子可以对外部信号产生反应。真核生物的转录过程(看书）DNA 序列。但不是启动子的一部分。4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增1. 转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。2.转录延伸3. 转录后加工真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。5端加帽 ;3端加尾； RNA 的剪接 ;RNA 的编辑

12、帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA 和核糖体的结合；m7Gppp 结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护 mRNA 免受 5核酸外切酶的降解，增强 mRNA 的稳定。多聚腺苷酸尾巴功能：提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性。2. 试比较原核和真核细胞的 mRNA的异同 . 原核生物原核生物 mRNA的半衰期短。许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在。 （单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA）其 5端无帽子结构，3端没有或只有较短的poly(A)。 SD序列： 原核生物起始密码子AUG上游 7-12 个核苷酸处有一被称为SD序列

13、的保守区。 mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列P85原核细胞mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽。（本条供参考）原核生物常以AUG（有时 GUG，甚至 UUG）作为起始密码子（本条供参考）真核生物：其 5端存在帽子结构。绝大多数真核生物mRNA具有 poly(A)尾巴。（组蛋白除外） 以单顺反子的形式存在其 RNA最多只能编码一个多肽。（本条供参考）真核生物几乎永远以AUG为起始密码子。 （本条供参考）RNA合成与 DNA合成异同点相同点：1、都以 DNA 链作为模板2、合成的方向均为5 33、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3 ,5 -磷酸二酯键，使核苷酸链延长。不同点：模板复制两条

14、链均复制转录模板链转录（不对称转录）原料dNTPNTP酶DNA 聚合酶RNA 聚合酶产物子代双链 DNA （半保留复制）mRNA ， tRNA ， rRNA配对A-T ； G-CA-U ； T-A ； G-C引物RNA 引物无mRNA3 类内含子剪接核酶的定义及发现第四章翻译： 指将 mRNA 链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的场所是核糖体蛋白质合成的模板是mRNA模板与氨基酸之间的接合体是tRNA蛋白质合成的原料是20 种氨基酸三联子密码定义： mRNA 链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘

15、酸就称为密码子或三联子密码 (triplet coden)遗传密码的性质：1、 连续性：编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。基因损伤引起 mRNA 阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation) 。从 mRNA 5AUG 到3多肽链，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF) 。2、简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（ synonymous codon）。编码某一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频率

16、就越高。Arg 例外3、通用性与特殊性蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。4、摆动性：转运氨基酸的tRNA 上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA 上的遗传密码子反向配对结合，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动” ，这种现象称为密码子的摆动性tRNA tRNA的结构的功能1、二级结构：三叶草形2、三级结构：“ L”形氢键1、解读mRNA的遗传信息2、运输的工具，运载氨基酸tRNA 有两个关键部位：3端 CCA ：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。与mRNA结合部位反密码子

17、部位tRNA tRNA凭借自身的反密码子与的种类mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。1、起始tRNA和延伸tRNA：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA ，其他tRNA统称为延伸tRNA 。真核生物：起始密码子原核生物：起始密码子AUG 所编码的氨基酸是Met ，起始AUG所编码的氨基酸并不是AA-tRNA 为甲硫氨酸本身Met-tRNAMet 。, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet2、同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA 称为同工tRNA 。同工 tRNA 既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要

18、有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA 合成酶识别（P119）。3、校正tRNA无义突变校正错义突变校正tRNA ：可以通过改变反密码子区校正无义突变tRNA ：通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。无义突变： 在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（ UAG 、UGA 、UAA ），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突变叫错义突变。GGA （甘氨酸）AGA （精氨酸）核糖体的结构与功

19、能1.核糖体是由rRNA（ribosomal ribonucleicacid）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。2.核糖体的功能：合成蛋白质在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。 mRNA 结合部位小亚基结合或接受AA-tRNA部位（ A 位）大亚基结合或接受肽基tRNA 的部位大亚基肽基转移部位（P 位）大亚基形成肽键的部位（转肽酶中心）大亚基蛋白质合成的过程(生物学机制）氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止蛋白质前体的加工肽链怎样进行进行终止的？终止因子RF1 ：识别终止密码子UAAR

20、F2 ：识别终止密码子UAARF3 ：具 GTP 酶活性，刺激和 UAG和 UGARF1 和RF2活性，协助肽链的释放真核生物只有一个终止因子（核糖体循环步骤？eRF）蛋白质的运转机制1、翻译-运转同步机制2、翻译后运转机制(1)线粒体蛋白质跨膜运转(2)叶绿体蛋白质的跨膜运转3、核定位蛋白的运转机制4、蛋白质的降解蛋白质运转的两种方式（蛋白质运转模式？怎样进行？）一 .翻译 -运转同步（ co-translational translocation ）：是即将进入内质网的蛋白质的易位方式；蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合；蛋白质合成时，核糖体定位于内质网表面，称膜结合核糖体(membra

21、ne-bound ribosome ）。分泌蛋白质大多是以同步机制运输的二 .翻译后运转（ post-translational translocation ）：蛋白质翻译完成后从核糖体上释放，然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合。蛋白质合成时，其核糖体不与任何细胞器相连，称游离核糖体(free ribosome)在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。参与生物膜形成的蛋白质，依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。信号肽假说内容：（ 1）蛋白质合成起始首先合成信号肽（ 2） SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停（ 3） SRP 与 SRP 受体结合，

22、核糖体与膜结合，翻译重新开始（ 4）信号肽进入膜结构（ 5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行（ 6）蛋白质完全过膜，核糖体解离第五章分子生物学研究法基因操作：主要包括DNA 分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR 扩增等。基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。基因工程所需元件：限制性内切酶 ;连接酶 ;载体 ;受体细胞常用的工具酶限制性核酸内切酶切割 DNADNA 连接酶生成 3 - 5磷酸二酯键DNA 聚合酶探针标记、补平 3末端反

23、转录酶cDNA 合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA 链中磷酸二酯键的核酸酶（ “分子手术刀”）。限制酶的命名命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序限制性内切酶的特点：（ 1） . 限制性内切酶一般识别完全的回文结构，它具有两个基本特点： 能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对； 两条互补链的5 3的序列组成相同，即将一条链旋转180 度，则两条链重叠。（ 2） . 识别 -8 个相连的核苷酸组成的特定核甘酸序列。

24、（ 3） 切割方式有两种错位切割，产生互补性的粘性末端。错位切割所产生的 DNA 末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的 DNA 分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。沿对称轴切割，产生平齐末端（ 4 具有同裂酶 :来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列。如： BamH I 和 Bst I 具有相同的识别序列GGATCC 。（ 5） 具有同尾酶 :来源各异，识别的靶序列也不同，但却产生相同的黏性末端，故同尾酶产生的黏性末端可以连接起来，但一般不能再被原来的任何一种酶所切割。如： Taq I 、 Cla I 和 Acc I 为一组同尾酶

25、，其中任何一种酶切割DNA 分子都产生5端 CG 凸出的粘性末端。目的基因的获得1）化学合成法：较短的基因（60-80bp ）用途： PCR 引物 ;测序引物 ;定点突变 ;核酸杂交探针重组 DNA 技术（ Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA 片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。基因组文库和cDNA 文库基因库，也叫基因组文库，DNA 文库（DNA library)是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。将生物细胞基因组DNA 通过限制性内切酶

26、部分酶解后所产生的基因组DNA 片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找（没有目录）。cDNA 文库 (P175): 首先获得mRNA ，反转录得cDNA ，经克隆后形成文库。cDAN 文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA 文库除却了mRNA 拼接过程中除去的内含子等成分，便于 DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的组建一个 cDNA 文库的步骤：1)分离表达目的基因的组织或细胞2)从组织或细胞中制备总体RNA 和 mRN

27、AcDNA分子的核酸序列直接推导出来。3）第一条 cDNA 链的合成，需要 RNA 模板，cDNA 合成引物，逆转录酶， 4 种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液 (Mg2+) 等。4)第二条 cDNA 链的合成5) cDNA 的甲基化和接头的加入6)双链 cDNA 与载体的连接据研究目的，选择克隆策略=> 控制基因表达的调控序列；中不存在的特定序列cDNAlibrary=> 蛋白质的氨基酸序列载体（ Vector） : 将外源目的DNA 导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体的条件分子小（10 Kb ）； 有限制酶酶切位点； 可自主复制；有足够的copy 数；带筛选的标志用于原

28、核生物宿主的载体：质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体用于真核生物宿主的载体：细菌人工染色体载体酵母人工染色体载体噬菌体 PI 载体和 PACPlasmid：质粒是细胞染色体或核区DNA 外能够自主复制的很小的环状DNA 分子质粒载体特点1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA 插入。3、 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA 分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 2）生化标记基因常用的遗传标记基因及其作用机制1) 四环素抗性基因（ Tetr ， T

29、cr）Tetracycline 可结合在核糖体 30s 亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种 399 AAs 蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2) 氨苄青霉素抗性基因（Ampr ， Apr ）Ampicillin 可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可特异地切割氨苄青霉素的 内酰胺环，使氨苄青霉素失活。氯霉素抗性基因（Cmlr， Cmr ）Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结

30、合在核糖体上。4) 卡那霉素 (Kanr),新霉素 (Neor) 和 G418 抗性 (G418r) 基因Kanamycin ，Neomycin 和 G418 均可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。5） 半乳糖苷酶基因（ 半乳糖苷酶基因有lacZ 和 lacZ ）1021 AAs（ 和 链）lacZ（ lacZ ）中含有多克隆位点，当无外源 DNA 片段插入时，质粒表达 半乳糖苷酶的 -肽，产生有活性的 半乳糖苷酶， 在含有指示剂 X-gal 和诱导剂 IPTG 的存在下， 菌落呈现兰色； 外源基因的插入后， 破坏了 lacZ -肽基

31、因的结构，细菌内不能产生 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化 X-Gal 水解为兰色产物， 检测直观；b. lacZ 编码 5 -端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性；c. lacZ 和 链基因的分别表达可使载体小而容量大分子杂交：是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.分子杂交包括： DNA-DNA 杂交（原位杂交、点杂交、 Southern 杂交），DNA-RNA 杂交（ Northern 杂交）及蛋白杂交（ Western 杂交）大多数的核酸杂交反应都是在固体支

32、持物（滤膜）上进行的。采用滤膜进行核酸杂交是因为它们易于操作及保藏。常用的滤膜有：醋酸纤维素滤膜、重氮苄氧甲基 (DBM)- 纤维素膜；氨基苯硫醚 (APT)- 纤维素膜，尼龙膜及滤纸等。Probe（杂交探针） ：探针，是由放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记后，能与目的基因片段特异性杂交的已知序列的核酸片段根据探针的来源及核酸性质不同又可分为 DNA 探针， RNA 探针， cDNA 探针，及寡核苷酸探针等几类缺口平移法（ Nick Translation ）标记探针的原理及过程（看书）DNA 杂交常用的方法（ 1）斑点杂交（ dot and slot hybridization)用途：

33、用于快捷地检查出菌落中是否有某个基因，但不能检出基因的大小或重复的程度。原理及步骤：提取 DNA点样品至膜、干燥、固定探针、 DNA 变性、杂交洗膜、放射自显影结果分析（二） . Southern DNA 印迹杂交将重组体 DNA 用限制酶切割，分离出目的DNA 后进行电泳分离，再将其原位转至薄膜上，固定后用探针杂交的方法叫 Southern 杂交。用途：用来检查DNA 样品中是否存在有某个特定的基因，而且还可知道其大小及酶切位点的分布。Southern blot 的步骤提取 DNA限制酶消化DNA 片段电泳分离变性转移至尼龙膜温育、探针杂交洗膜、放射自显影、结果分析（三） .菌落印迹原位杂交

34、(in situ hybridization)让含重组体的菌落或噬菌斑由平板转移到膜上并释放出杂交。用途：用于在转化菌落中筛选带有目的基因的重组克隆RNA 杂交常用方法Northern RNA印迹杂交DNA ，变性并固定在膜上，再同DNA探针杂交的方法叫原位将 RNA 分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法，被检对象为 RNA, 探针为 DNA 或 RNA.用途：用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录。原理及步骤：提取总RNA提纯分离mRNA琼脂糖凝胶电泳分离RNA转移至硝酸纤维素膜杂交检测蛋白质印迹法（Western bloting)Wes

35、tern blotting 分析(p189)是蛋白质分析的技术在基因表达研究中，应用非常广泛，因为蛋白质是基因的产物，研究蛋白质的变化来分析判断基因转录的高与低。步骤：细胞提取总蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜（Western blotting ，常用醋酸纤维膜）固定用化学发光试剂标记（抗体抗原反应）分析相对量以判断表达量的多少。PCR(polymerase chain reaction) 是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA 合成技术。PCR 相关技术 (看书）群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体 DNA 于内含子序列中，表型并没有改

36、变，这种表现称为是不完全相同的，一般每DNA 多态100 500bp 就有一个是不相同的，它们多位基因多态性的检测方法1. PCR-RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)2. PCR-RFLP(Restrict Fragment Length Polymorphroism)3. PCR-SSCP(Single-Stranded Conformation Polymorphroism) RNA 的转录后加工；4. 小卫星标记（ minisatellite DNA ）5. 微卫星标记（ microsatellite DNA ）6.单核苷酸多态性（sing

37、le nucleotide polymorphism ,SNP）4. 基因芯片（Gene chip ）分子遗传标记的应用种质资源的遗传评估、监测、保护和利用;遗传图谱的构建与基因定位第六章原核生物基因表达调控（定）围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为基因表达调控转录水平的调控；转录后的调控；翻译水平的调控基因表达的方式1、组成性基因表达; 标记辅助选择.指不大受环境变动而变化的一类基因的表达。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶等代谢过程中十分必须的蛋白质或酶的表达。某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(house-keeping gene)。如：微管蛋白

38、基因、糖酵解酶系基因、核糖体蛋白基因等。2、适应性表达（诱导和阻遏表达）指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。诱导表达（ induction）指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。、阻遏表达（ repression）指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。协调表达在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达(coordinate expression)，这种调节称为协调调节(coordinate regulation) 。DNA RNA水

39、平：基因丢失；基因扩增；基因重排；甲基化修饰；染色体的机构状态水平：转录水平调控；RNA 的转录后加工；mRNA 从核内向胞浆转运；mRNA稳定性蛋白质水平：翻译过程；翻译后加工；蛋白质稳定性原核基因调控机制的类型1、负调控negative regulation样的控制系统就叫做负控系统其调节蛋白质叫做阻遏蛋白两种类型：负控诱导和负控阻遏在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被关闭，这。2、正调控positive regulation在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的控制系统就叫做正控系统。其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白

40、（激活蛋白)两种类型 :正控诱导和正控阻遏系统原核生物基因表达调控的特点：调节的主要环节在转录水平上进行；因子决定RNA 聚合酶识别特异性；主要通过操纵子模式进行调节；阻遏蛋白对转录的抑制作用（阻遏机制）是普遍存在的负调控作用乳糖操纵子与负控诱导系统以及色氨酸与负控诱导系统（重点看）举例说明原核生物基因表达调控的机理。（参考）在 E.coli 乳糖操纵子中，其结构基因为lacZ,lacy,lacA,这三个基因别离编码-D 半乳糖苷酶， -D 半乳糖苷透性酶， -D 半乳糖苷转乙酰酶。其调节基因为lacI, 编码阻遏蛋白。启动子为lacP, 操纵基因为 lacO 。负调控：当细胞内无引诱物时，阻

41、遏蛋白能够与操纵基因联合。因为操纵基因与启动子有一定程度的重叠，是以妨碍了RNA聚合酶在-10 序列上形成开放性的启动子复合物。当细胞内有引诱物存在时，引诱物以极高的浓度与阻遏蛋白快速联合，从而改变了阻遏蛋白的构象，使之快速地从操纵基因上解离下来。这样，RNA 聚合酶就能与启动子牢固联合并形成开放性启动子复合物，从而开始转录lacZYA 结构基因。正调控：cAMP-CAP复合物是乳糖操纵子的正调控因子。乳糖启动子有两个 CAP联合位点， 一个是在 -70 到 -50（位点 I ）, 另一个是在 -50-D-40（位点 II ）。位点 I 包含一个逆向反复序列，这彷佛是大多数强联合位点的特征。位

42、点II是一个很弱的联合位点，但是当cAMP-CAP复合物联合于位点I 时，位点II 联合 cAMP-CAP复合物的能力显著提高。 一旦位点 II 被占领， RNA聚合酶就很快与 -35 序列联合， 然后在于 -10 序列联合。转录水平上其他的调控方式，以及转录后调控(看书 )第八章真核基因表达与调控真核生物基因表达的调控的水平DNA 水平的调控转录水平的调控;转录后水平的调控;翻译水平的调控 ;翻译后水平的调控 ;真核基因组的结构特点1、在真核细胞中，一条成熟的mRNA 链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。2、真核细胞 DNA 都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一

43、小部分DNA 是裸露的。3、高等真核细胞DNA 中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。4、真核生物能有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA 片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。5、在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，一般通过改变整个所控制基因5上游区 DNA 构型来影响它与 RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑RNA 聚合酶与它的结合。6、真核生物的RNA 在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔

44、。7、许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程才能顺利地翻译成蛋白质。基因家族定义：真核基因组中来源相同,结构相似 ,功能相关的一组基因.可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。外显子与内含子的可变调控组成型剪接：切除内含子后，将外显子规范地拼接成成熟的mRNA ，称为组成型拼接。这样一个基因只产生一种成熟的 mRNA ，也只产生一种蛋白质产物。选择性剪接：可调控的选择性拼接，因而产生不同的成熟mRNA ，翻择产生不同的蛋白质。真核生物 DNA 水平上的基因表达调控“开放”型活性染色质结构对转录的影响；基因扩增；基因重排与转换；基因丢失；基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，

45、它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调节的一种方式.一个基因可以从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录，即在DNA水平上由无功能的基因片断组合重排成为有功能的基因单位的过程，叫做基因重排基因丢失 :有的生物个体发育早期在体细胞中要丢失部分染色体，而在生殖细胞中保持全部的基因组DNA 甲基化与基因活性的调控DNA 的甲基化： DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达；DNA 的甲基化能提高该位点的突变频率，因而可作为诱变剂或致癌因子调节基因表达。甲基化的类型：5甲基胞嘧啶；N6 甲基腺嘌呤；7甲基鸟嘌呤DNA的甲基化机制

46、基因转录的机理甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA 向 Z-DNA白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化， 影响蛋白质与DNA的相互作用； 抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。真核生物转录水平的调控RNA聚合酶；顺式作用元件；反式作用因子；转录起始的调控真核基因启动子由核心启动子和上游启动子元件（UPE ）两个部分组成.在基因转录起始位点(+1) 及其 5上游大约100200bp 以内的一组具有独立功能的DNA 序列 .决定 RNA 聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件.核心启动子 (core promoter) 保证 RNA 聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA 序列。包括转录起始位点及转录起始位点上游-25 -30bp 处的 TATA 盒。