ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响

1、zds基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生 物合成的影响江露班秋丽汪善良贵州安为天检测技术有限公司摘要：烟草类胡萝卜素对烟叶品质和可用性有重要作用，乙-胡萝卜素脱氢酶(zds) 是调控类胡萝卜素合成积累的关键酶之一。为研究zds基因干扰表达对烟草类胡 萝卜素生物合成的影响，从贵州省烟草科学研究院福泉试验基地取样品，采用 不同株系相同部位的方式取样，与贵烟1号(gy1)对照，筛选出能够构建rna 干扰(rnai)载体并成功转化的转基因植株，建立zds基因的sybr green i实 时荧光定量rt-pcr的检测方法，检测新鲜烟叶屮zds基因表达水平并分析其遗 传表型的变化。结果表明，zds和其他类胡萝

2、卜素合成关键酶基因的表达均下调, 其遗传后代出现界于正常植株的白化与矮化的表型。证明了 zds基因对产生这种 异同发挥了作用，也充分佐证了 rnai技术在基因功能分析中有着重要的作用， 但这些样品表现出白化和矮化的表型是否是由于烟草类胡萝卜素的合成受到抑 制尚不确定，还需要进一步验证。关键词：烟草类胡萝卜素;zds基因;实时荧光定量pcr; rna干扰;作者简介：江露(1991-)，男，江西铅山人，助理工程师，从事食品安全与环 境检测方面的研究工作。收稿日期：2017-07-19effects on tobacco carotenoidbiosynthesis of expression of

3、 zdsgene interferencejiang lu ban qiuli wang shan-liangguizhou anweitian detecting technology co.,ltd.;abstract：tobacco carotenoids had an important effect on leaf quality and availability. -carotene desaturase (zds) was a key enzyme in the regulation of carotenoid biosynthesis. in order to study th

4、e interference of zds gene expression of carotenoid biosynthesis in tobacco, this paper took samples from fuquan test base of guizhou provincial academy of tobacco science, using different strains of the same parts of the sampling methods, scalding out the transformed transgenic plants of rna int er

5、f ere nee (rnai) vector from tobacco on the 1 st (gy 1) . zds gene sybr green t rtfq rtpcr test method was built for detecting fresh tobacco leaves zds gene expression levels and phenotypic analysis of genetic variation. the resuits showed that zds and other carotenoid synthesis gene expression of k

6、ey enzymes decreased, and their genetic offspring albino and dwarf phenotype were different from normal plants. it proved that zds genes played a key role in those simi lari ties and differences, and i t also demonstreitcd that the rnai technology played an importemt role in the analysis of gene fun

7、ction. but it was not sure that the albino and dwarf phenotype of these samples was due to carotenoid synthesis inhibited in tobacco and i t needed further validation.keyword：tobacco ceirotcnoid; zds gene; rtfq rt-pcr; rna interfercncc;received： 2017-07-19植物类胡萝卜素主要分布在植物叶绿体和有色体膜中，而新鲜烟叶中的类胡萝 卜素主要有叶黄素、

8、新黄质、紫黄质和胡萝卜素。类胡萝卜素作为许多重要 的香味成分的前体，在烟味的形成过程中起着重要的作用口辺。高等植物类胡 萝卜素生物合成途径包括异戊二烯焦磷酸生物合成、八氢番茄红素生物合成、番 茄红素生物合成、胡萝卜素生物合成、叶黄素生物合成和萝卜素裂解等过程固。 由图1可知，异戊烯焦磷酸异构酶(ipp)、犍牛儿犍牛儿基焦磷酸合成酶 (ggps)、八氢番茄红素合成酶(psy)、八氢番茄红素脱氢酶(pds)、匚-胡萝 卜素脱氢酶(zds)、番茄红素b环化酶(lcyb)、番茄红素£环化酶(lcye), 其均位于类胡萝卜素合成途径屮生成q-胡萝卜素和b-胡萝卜素的基因上游， 其中某一个基因表

9、达异常并不能说明整个类胡萝卜素合成代谢途径异常甚至终 止。因此，在研究某一个基因表达情况时，往往需要考虑其他上下游基因表达的 情况。基因表达，即dm到蛋白质的过程。其中，蛋白质由mrna编码而成，利用实时 荧光定量rt-pcr6-9对其进行定量分析以获取其基因表达水平。而对于基因表 达调控，通过rna干扰10-11 (rnai)载体构建人为引入与內源靶基因具有相 同序列的非正常双链rna (ds rna),从而诱导內源靶基因m rna降解，达到阻 止基因表达的目的，使细胞出现靶基因缺失的表型，引发植物r7a沉默，主要 有转录水平的基因沉默(tgs)和转录后水平的基因沉默(ptgs)。而ptgs

10、在植 物基因研究屮有着极其重要的应用，比如植物基因功能分析、作物品种改良、抗 病虫和抗逆性等方面12。在多种植物如水仙、小麦和草莓中都有匚-胡萝卜素 脱氢酶基因的相关研究报道13-15,通过基因表型变化，鉴定该基因功能，而 有关烟草中g-胡萝卜素脱氢酶基因特性与rnai引起的基因沉默尚未见报道。 因此，本研究针对zds基因干扰在烟草类胡萝卜素中的表达情况，建立高效可 控的sybr green i实时荧光定量pcr检测法，准确定量地检测zds基因表达水 平，对研究烟草类胡萝卜素的生物合成具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料通过 ta ka ra 公司 prime scriptlst stra

11、nd c dna synthesis kit 试剂盒提取 的烟草 c dna 模板，sybr premix dimer eraser (sox),上下游引物，rox i, 灭菌水,冰块，量程 1 ml、200ul、100ul、20ul、10ul、25ul 的 eppendorf 移液枪及枪头，abi公司stepone,微孔板迷你离心机，迷你离心机，一次性医 用橡胶手套与口罩，记号笔。1.2试验方法 参照烟草基因zds全序列疋1和ipp、lcye、lcyb.内参基因gcnc21的全序列, 用primer premier v5. 0软件设计引物，引物序列见表1。表1基因zds、gene21>

12、 ipp、lcye和lcyb的引物序列下载原表使用stepone时，设置rt-pcr反应系统为sybr r green reagents,定量方法 为 quant i tat ion-comparat i ve ct (a a ct),程序运行速度为标准 standard, 模板类型选择c dnao各c dna样品分别以zds、ipp、lcye、lcyb和gene21引 物进行定量pcr反应。反应体系为20 11 l:sybr premix dimer eraser (50x)10 ul,上下游引物分别为0. 6 u l, rox i 0. 4 u l, c dna模板1 u l,灭菌水7.4

13、ulo反应程序采用三步法:95°c预变性30 s、95°c变性5 s、60°c退火30 s （收集信号），72°c延伸30 s, 40次循环，溶解曲线条件为95°c30s、60°c30 s、 95°c15s（收集信号）。每个pcr反应重复2次，并且设立空白对照和非转基因 gy1的对照组。在每一循环的退火阶段收集荧光信号以便进行实时检测。反应结 束后得到含有所有标本的记录点曲线。在调整baseline cycles和计算 thresholdvalue （阈值）后，得出循环阈值 cycle threshold （即 ct 值）。

14、2结果与分析2.1检测基因表达的准确性样品在荧光定量pcr仪上扩增后，得到1条反映核酸扩增zds基因过程的s形荧 光定量动力学曲线（图2）。用循环阈值（ct）作为临界点，该点位于pcr产物 消除荧光背景后进入指数扩增期的开始点。可以看出，荧光定量动力学曲线基线 平整，指数区斜率较大且比较平滑，扩增曲线比较理想。同时，空白对照组一肓 保持水平线，无引物二聚体产生。图2样品扩增曲线下载原图对于基因表达的准确性还必须注意到荧光pcr产物的溶解曲线，用于判断产物 是否相对专一。温度升高使双链pcr产物解链，以致于不能与荧光染料sybr green i分子结合，荧光信号减弱。刚开始升温时荧光信号变化不大

15、，当温度接 近解链温度时，信号变化过大而出现了峰值。再加热，双链pcr产物解链，所以 儿乎是平的，接近解链温度tm时，突然变化加大，所以岀现峰值。再升温，产 物全部解离，就又是一条直线了。在加热过程中出现一些比较矮、宽的峰（图 3）,这是由于非特异性产物的影响，因而这一试验数据就不能采用。若是阴性 对照gy1出现非特异性产物，那么这一样品就不能作为对照，在steponc的分析 中换成溶解曲线正常的对照。图4为荧光pcr产物的溶解曲线，同一引物tm值 较稳定，有一些矮但并不宽的峰，非特异性产物不明显，基因表达结果能够说 明问题。2. 2检测基因表达的重现性为了验证该技术方法的重复性，以同一个c

16、dna样品为例进行重复测定，2次重 复的误差和变异系数都较小（表2）。同时从图2的s型荧光定量曲线也可看出, 曲线的重复性和稳定性很好，在扩增前期，特别是在阈值附近，同一样品的曲 线基本是重叠的，扩增后期即进入平台期后曲线仍比较平稳，符合s型。图3荧光pcr非特界性产物溶解曲线 下载原图图4荧光pcr产物溶解曲线下载原图 表2部分样甜zds和其他基因表达量的重现性（ct值） 下载原表2.3 zds基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响不同样品对烟草zds基因表达的影响如图5所示，其中gene21为内参基因，gy1 为非转基因对照组。诱导zds基因在m rna转录水平上的表达结果显示，样品

17、140-7和140-10对zds基因表达均明显下调，而ipp、lcye、lcyb也同时表达 下调。由图1植物烟草类胡萝卜素的生物合成途径可知，ipp、zds、lcye、lcyb 均为参与烟草类胡萝卜素牛物合成的重要酶之一，其中一个受到干扰，都会影 响类胡萝卜素的生物合成。ipp位于zds的基因上游，lcye和lcyb位于zds的 基因下游，若zds基因表达下调，那么ipp基因表达的产物就会不断积累，产生 负反馈调节，最终抑制了上游产物异戊烯焦磷酸的合成，而出现1pp基因表达 下调的情况。此外，zds基因表达受限，导致产物番茄红素含量下降，而番茄红 素分别在lcye和lcyb这2种酶的作用下牛成

18、a -胡萝卜素和b -胡萝卜素的这 一代谢效率降低，产生正反馈调节，最终也抑制了胡萝卜素和胡萝卜素 酶的合成，而出现lcye和lcyb基因表达下调的情况。若这种猜图5烟草中zds在m r7a转录水平的表达量（a）及其对数值（b） 下载原 图测成立，将更好地解释分子生物学中基因沉默的规律变化。从图5还可看出，样甜140-7的基因相对表达量较140-10的相对表达量低，说 明干扰载体对140-7的zds基因的干扰效率较140-10的高。通过rnai载体构建 得到的烟草转基因阳性植株，其种子在营养基质中播种后，与对照样品gy1比 较，140-7出现大面积的白化和矮化表型，140-10出现部分的白化，

19、矮化暂不明 显（图6）。由此表明，通过rnai这一技术降低烟草屮zds基因的表达后，使 得其与正常植株相比表现出了异同，证明zds对产生这种异同发挥了作用。图6部分转基因烟草种子播种后的植株与对照gy1号 下载原图3结论与讨论采用sybr green t实时荧光定量rt-pcr展开zds基因干扰表达试验，结果表明,zds基因表达下调，其他关键酶基因也随z下调，说明zds基因干扰表达能够影 响烟草类胡萝卜素的生物合成。通过rnai这一技术使得烟草中zds基因的表达 水平降低，岀现了异于正常植株的表型变化，证明了 zds对产生这种异同发挥 作用。木试验定量检测了 zds基因干扰表达对烟草类胡萝卜素

20、的牛物合成的影响, 对阐明烟草类胡萝卜素中致香前体物合成途径所需的关键酶基因表达以及功能 具有重要的借鉴作用。参考文献1 周莉，刘莉类胡萝卜素牛物合成的调控因素及其对光合作用的影响j天 津农业科学,2011, 17 (5) :5-&2 李爱军，代惠娟，娄本，等烟草类胡萝卜素研究进展j 安徽农业科学， 2008, 36 (6) : 2364-2366.3 储大燕烟草中类胡萝卜素及其异构体的分析研究d北京：中国科学技术大 学，2009.4 张建成，刘和.植物类胡萝卜素生物合成极其调控与遗传操作j中国农学 通报，2007, 23 (11) :211-21 &5 周昆，周清明，胡晓兰烤烟香气物质研究进展j中国烟草科