饲料中粗蛋白测定实用教案

1、 一、蛋白质的测定方法一、蛋白质的测定方法2 2间接法间接法 通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量（根据（根据(gnj)(gnj)：每种蛋白质的含氮量是恒定的，：每种蛋白质的含氮量是恒定的，N N6.256.25）。）。凯氏定氮法（凯氏定氮法（KjeldahlKjeldahl）8989小时小时杜马斯燃烧定氮法（杜马斯燃烧定氮法（Dumas Combustion Dumas Combustion MethodMethod）90012009001200高温燃烧，燃烧过程中产生混高温燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被一系列适当的吸收合气体，其中的干扰成

2、分被一系列适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部还原剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测。成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测。3 35 5 分钟分钟强碱直接蒸馏法强碱直接蒸馏法 样品在强碱溶液中消煮，样品在强碱溶液中消煮，使蛋白质中的不稳定氮素以氨的形式释放出来，使蛋白质中的不稳定氮素以氨的形式释放出来，在在 一定条件下，所释放的氨和样品中的一定条件下，所释放的氨和样品中的含氮量成正比且有很好的相关性，建立含氮量成正比且有很好的相关性，建立 不稳定氮量与全氮量之间的回归方不稳定氮量与全氮量之间的回归方程。程。 2020分钟分钟 纳氏试剂比色

3、法纳氏试剂比色法 12/5/2021 5:37 PM第1页/共36页第一页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量u19世纪（1883）建立的经典方法，结果可靠（最常用的标准(biozhn)方法），凯氏定氮法由于具有测定总有机氮量准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准(biozhn)分析方法。u但操作费时（89 h）改良方法：加催化剂加快分析速度、仪器改进（自动、半自动凯氏定氮仪）。 12/5/2021第2页/共36页第二页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量1. 1. 原理原理 各种饲料

4、的有机各种饲料的有机(yuj)(yuj)物质在还原性催化剂（如物质在还原性催化剂（如CuSO4CuSO4，K2SO4K2SO4或或Na2SO4Na2SO4或或SeSe粉）的帮助下，用浓硫粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机(yuj)(yuj)态氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定处理下也包括硝酸态态氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成氨）都转变成NH4+NH4+并与并与H2SO4H2SO4化合成（化合成（NH4NH4）2SO42SO4，而非含氮物质，则以，而非含氮物质，则以CO2CO2，H2OH2O，SO2SO2状态逸出

5、。然状态逸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。含量。12/5/2021第3页/共36页第三页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量1. 1. 原理原理 ：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮； ：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则 被还原成二氧化硫；被还原成二氧化硫； 2H2SO4 2H2SO4 C C 2SO22SO2 2H2O 2H2O

6、CO2CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性(sun (sun xn)xn)溶液中。溶液中。 H2SO4 H2SO42NH3 2NH3 (NH4)2SO4 (NH4)2SO412/5/2021第4页/共36页第四页，共36页。第5页/共36页第五页，共36页。第6页/共36页第六页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量1. 1. 原理原理(yunl)(yunl) 消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并消化液在浓碱的作用下进行

7、蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵。与之结合成为四硼酸铵。 12/5/2021第7页/共36页第七页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量1. 1. 原理原理 以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HClHCl标准溶液标准溶液（0.1mol/L0.1mol/L）滴定，根据）滴定，根据(gnj)(gnj)标准酸的消耗量，即标准酸的消耗量，即可计算有机氮的含量。而后，根据可计算有机氮的含量。而后，根据(gnj)(gnj)不同的饲料不同的饲料再乘以一定的系数（通常用再乘以一定的系数（通常用6.256.25系数计算），即为粗系数计算），即为粗

8、蛋白质的含量。蛋白质的含量。 12/5/2021第8页/共36页第八页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏装置(zhungzh)硫酸铜硫酸钾硫酸2%硼酸溶液 40%氢氧化钠(qn yn hu n)溶液 0.2%甲基红 0.2%溴甲酚绿 0.2%甲基红及0.2%溴甲酚绿的1+5混合指示剂 0.1mol/L的标准盐酸溶液(或1/2硫酸溶液) 2. 2. 主要仪器及试剂主要仪器及试剂12/5/2021第9页/共36页第九页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第一步第一步 样品样品(yngpn)(yngpn)

9、消化消化 称取适量样品称取适量样品(yngpn)0.51g(yngpn)0.51g（含氮量（含氮量5 580mg80mg），），无损失（用滤纸包好）地放入干燥凯氏烧瓶或消化管中，加无损失（用滤纸包好）地放入干燥凯氏烧瓶或消化管中，加入入0.2g0.2g硫酸铜（硫酸铜（CuSO45H2OCuSO45H2O），），3g3g无水硫酸钾（或无水硫无水硫酸钾（或无水硫酸钠）及酸钠）及10mL10mL硫酸，轻轻摇匀后进行消化。硫酸，轻轻摇匀后进行消化。（样品（样品(yngpn)(yngpn)CuSO45H2OCuSO45H2OK2SO4K2SO4浓硫酸）浓硫酸） 透明蓝绿色透明蓝绿色空白试验：取与处理样品

10、相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一(tngy)方法作试剂空白试验。12/5/2021第10页/共36页第十页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第一步第一步 样品消化样品消化 硫酸铜硫酸铜/ /无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！） （1 1）K2SO4K2SO4或或Na2SO4Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快的作用：提高溶液的沸点而加快(ji kui)(ji kui)有有机物的分解；机物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO

11、4=K2SO4+H2O+SO3 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。已生成的铵盐发生热分解而造成损失。12/5/2021第11页/共36页第十一页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第一步第一步 样品消化样品消化 硫酸铜硫酸铜/ /无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）用？（大家想想！） （2 2）CuSO4CuSO4的作用的作用 催化剂，加速氧化分解；催化剂，

12、加速氧化分解； 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。的蓝绿色。 可以指示消化终点的到达；可以指示消化终点的到达； 下一步蒸馏下一步蒸馏(zhngli)(zhngli)时作为碱性反时作为

13、碱性反应（加入碱量）的指示剂。应（加入碱量）的指示剂。12/5/2021第12页/共36页第十二页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第一步第一步 样品消化样品消化注意事项：总氮测定时，消化至关注意事项：总氮测定时，消化至关重要。重要。 消化在通风橱中进行（若无通风消化在通风橱中进行（若无通风橱橱.）。）。 在消化开始时，应控制火力（应在消化开始时，应控制火力（应从低温开始分阶段升温至从低温开始分阶段升温至360360410 410 ），保持缓慢沸腾，避免），保持缓慢沸腾，避免试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。实验实

14、验(shyn)(shyn)中要保证硫酸足量，中要保证硫酸足量，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，而削弱了硫酸的消化作用。而削弱了硫酸的消化作用。12/5/2021第13页/共36页第十三页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步第二步 氨的蒸馏氨的蒸馏 样品分解液定容样品分解液定容 试样消煮液令却，小心加试样消煮液令却，小心加20ml20ml水，移人水，移人100ml100ml容容量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为容置瓶中，再加水至刻度，

15、作为(zuwi)(zuwi)试样分解试样分解液备用。液备用。12/5/2021第14页/共36页第十四页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步第二步 氨的蒸馏氨的蒸馏 蒸馏蒸馏 蒸汽发生器的准备：蒸汽发生器的准备：装好定氮装量，于水蒸气发装好定氮装量，于水蒸气发生瓶内装蒸馏水至约生瓶内装蒸馏水至约2 23 3处，处，加甲基红指示液数滴及硫酸加甲基红指示液数滴及硫酸数滴，以保持水呈酸性（水数滴，以保持水呈酸性（水为橙红色，否则补加硫酸，为橙红色，否则补加硫酸，大家想想为什么？）。加入大家想想为什么？）。加入数粒数粒(sh l)(sh l)玻璃珠

16、以防暴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。沸水蒸气发生瓶内的水。防止水中氨态氮防止水中氨态氮的逸失而影响的逸失而影响(yngxing)测测定值。定值。12/5/2021第15页/共36页第十五页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步第二步 氨的蒸氨的蒸馏馏 蒸馏蒸馏 硼酸溶液的准备：硼酸溶液的准备：向接收瓶内加入向接收瓶内加入20mL2%20mL2%硼酸及硼酸及2 2滴混滴混合合(hnh)(hnh)指示剂并指示剂并使冷凝管下端插入使冷凝管下端插入液面下。液面下。 12/5/2021第16页/共36

17、页第十六页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步第二步 氨的蒸馏氨的蒸馏 蒸馏蒸馏 开始蒸馏：吸取开始蒸馏：吸取10.0mL10.0mL样品消化稀释样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用液注入凯氏定氮仪的反应室中，用10mL10mL蒸蒸馏水冲洗进样入口，再加馏水冲洗进样入口，再加10mL40%10mL40%氢氧化氢氧化钠溶液入反应室（动作要快，以防氨逸钠溶液入反应室（动作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，在入口处加水密出），塞好入口玻璃塞，在入口处加水密封，防止漏气。打开水蒸汽发生器与反应封，防止漏气。打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子

18、，蒸汽通入反应室使氨气被室之间的夹子，蒸汽通入反应室使氨气被蒸发出来，并通过冷凝蒸发出来，并通过冷凝(lngnng)(lngnng)管而管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏时，蒸馏5min5min，使冷凝，使冷凝(lngnng)(lngnng)管离管离开吸收液面，在蒸馏开吸收液面，在蒸馏1min1min，用水冲洗冷凝，用水冲洗冷凝(lngnng)(lngnng)管末端，洗液流入接收瓶中，管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。取下接收瓶。 最后关闭电源，绝不能先关闭电源，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸！否则吸收液将发生倒吸！

19、12/5/2021第17页/共36页第十七页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步第二步 氨的蒸馏氨的蒸馏注意事项：注意事项：凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查前应检查(jinch)(jinch)定氮仪各导管间的连接处是否密定氮仪各导管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；闭，以免产生泄露；测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数次；次；蒸馏后立即清洗蒸馏器。蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸馏后立即清洗蒸馏器。蒸馏完毕后，移取

20、热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。瓶。12/5/2021第18页/共36页第十八页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第

21、三步第三步 滴定滴定用微量酸式滴定管，以用微量酸式滴定管，以0.10.1或或0.02mol/L0.02mol/L盐盐酸标准溶液进行滴酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。变为灰红色为终点。空白试验：同时空白试验：同时(tngsh)(tngsh)取取10.0mL10.0mL空白消化稀释液同空白消化稀释液同上操作，以校正药上操作，以校正药品不纯所发生的误品不纯所发生的误差。差。 12/5/2021第19页/共36页第十九页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量4 4结果计算结果计算CPCP样品中蛋白质的含量（样品中蛋白质的含量（% %）；）；V1V1样品

22、消耗样品消耗(xioho)(xioho)盐酸标准液的体积（盐酸标准液的体积（mLmL）；）；V2V2空白实验消耗空白实验消耗(xioho)(xioho)盐酸标准液的体积（盐酸标准液的体积（mLmL）；）；CC盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（mol/Lmol/L）；）；0.0140.014每毫升盐酸标准液（每毫升盐酸标准液（1 mol/L1 mol/L）相当于氮的克数；）相当于氮的克数；mm样品质量（样品质量（g g）；）；6.256.25氮换算为蛋白质的系数（换算系数）。（大家想想氮换算为蛋白质的系数（换算系数）。（大家想想6.256.25是如何计算出来的？

23、）是如何计算出来的？） 12/5/2021第20页/共36页第二十页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量5. 5. 方法的评价方法的评价凯氏法的优点是适用范围广，可用于凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种动植物的各种( zhn)( zhn)组织，组织，器官、各种器官、各种( zhn)( zhn)饲料等成饲料等成组复杂样品的测定，只要细心操作组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到较准确的结果，至今仍被都能得到较准确的结果，至今仍被作为标准检验方法。但此法灵敏度作为标准检验方法。但此法灵敏度低，适用于低，适用于0.2-1.0mg 0.2-1.0mg 氮，操作氮，操作比较复

24、杂，所需时间长。比较复杂，所需时间长。 用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以这样的非蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。测定结果称为粗蛋白。 事件事件(sh(shjin)jin)12/5/2021第21页/共36页第二十一页，共36页。 二、凯氏定氮法测定粗蛋白(dnbi)含量5. 5. 方法的评价方法的评价不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其

25、含氮量也不同（约在不同的蛋白质其含氮量也不同（约在14.714.719.519.5，平均平均(pngjn)(pngjn)为为1616），因而不同蛋白质系数也），因而不同蛋白质系数也不一样。不一样。 几种饲料原料蛋白质含氮百分数和蛋白质系数几种饲料原料蛋白质含氮百分数和蛋白质系数 原料原料 蛋白质含氮量蛋白质含氮量 蛋白质系数蛋白质系数 小麦、大麦小麦、大麦、燕麦、黑麦、燕麦、黑麦 17.60 5.70 稻谷稻谷 16.81 5.95 玉米、荞麦玉米、荞麦 16.66 6.00 高梁高梁 17.15 5.83 大豆、豌豆大豆、豌豆 17.60 5.70 花生、向日葵花生、向日葵 18.20 5.

26、50 牛奶及其制品牛奶及其制品 15.67 6.38 鸡蛋鸡蛋 16.00 6.25 oTyr（酪氨酸）：分子量181.9，含氮量7.69；oAla（丙氨酸）：分子量89.1，含氮量15.7；oLys（赖氨酸）：分子量146.9，含氮量9.06。12/5/2021第22页/共36页第二十二页，共36页。 三、蛋白质含量测定(cdng)的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（一）双缩脲法（Biuret法）法）1原理原理(yunl) 双缩脲是两个分子脲经双缩脲是两个分子脲经180左右加热，放出左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。一个分子氨后得到的产物。NH2-CO-NH2 + NH2-CO-NH2

27、NH2-CO-NH-CO-NH2 + NH3 在强碱性溶液中，双缩脲与在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色形成紫色络合物，称为双缩脲反应。络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质及多肽含有这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质及多肽含有两个以上的肽键（两个以上的肽键（CONH），与双缩脲的），与双缩脲的结构类似，也能与结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最形成紫红色络合物，其最大光吸收在大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的

28、组成无成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关。故可用来测定蛋白质含量。关。故可用来测定蛋白质含量。 12/5/2021第23页/共36页第二十三页，共36页。 三、蛋白质含量测定的其它(qt)方法（直接法）（一）双缩脲法（一）双缩脲法（Biuret法）法）1原理原理 在一定条件下，未知样在一定条件下，未知样品的溶液品的溶液(rngy)与标准与标准蛋白质溶液蛋白质溶液(rngy)同时同时反应，并于反应，并于540560nm下比色，可以通过标准蛋下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白的蛋白质浓度，标准蛋白溶液溶液(rngy)可以用结晶可以用结

29、晶的牛（或人）血清白蛋白、的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。制。12/5/2021第24页/共36页第二十四页，共36页。 三、蛋白质含量测定的其它方法(fngf)（直接法）（一）双缩脲法（一）双缩脲法（Biuret法）法）2方法评价方法评价该法的优点是样品不需消化处理，结果为饲料中蛋该法的优点是样品不需消化处理，结果为饲料中蛋白质的真实含量，操作简单，具有快速、准确白质的真实含量，操作简单，具有快速、准确等优点。但二肽含量不能测定（想想为什等优点。但二肽含量不能测定（想想为什么？）。么？）。该法灵敏度低，测定蛋白质的浓度范围适于该法灵敏度低，测定蛋白质的

30、浓度范围适于110mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，但并不需要十分精确定，但并不需要十分精确(jngqu)的蛋白质测的蛋白质测定。定。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液缓冲液和某些氨基酸等。除和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反应外，有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等，等基团亦有此反应。基团亦有此反应。 12/5/2021第25页/共36页第二十五页，共36页。 三、蛋白质含量测定的其它方法(fngf)（直接法）（二）（二）Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry

31、法法)1原理原理 此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，酚试剂，以增加显色量，从而从而(cng r)提高了检测蛋白质的灵敏度。提高了检测蛋白质的灵敏度。 这两种显色反应产生深兰色，原因是：在碱性这两种显色反应产生深兰色，原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰中的酪氨酸或色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混

32、合物）。在一定的条件下，兰色深度与和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。蛋白的量成正比。 12/5/2021第26页/共36页第二十六页，共36页。 三、蛋白质含量测定的其它方法(fngf)（直接法）（二）（二）Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)2方法评价方法评价本法的优点是操作简便、灵敏度高本法的优点是操作简便、灵敏度高, 定量范围为定量范围为5100g蛋白质，较双缩脲法灵敏蛋白质，较双缩脲法灵敏100倍。倍。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。其不足之处是此反应受多种因素干扰。其不足之处是此反应受多种因素干扰。Fol

33、in试剂显试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。扰作用。不同不同(b tn)蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同(b tn)而使显色强度稍有不同而使显色强度稍有不同(b tn)，显色的，显色的深浅往往随不同深浅往往随不同(b tn)的蛋白质而变化。因而的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。（相对于标准蛋白质）。Folin酚试剂的配制较为困难（现在

34、已可以订购）。酚试剂的配制较为困难（现在已可以订购）。12/5/2021第27页/共36页第二十七页，共36页。 三、蛋白质含量测定的其它(qt)方法（直接法）（三）紫外吸收法（三）紫外吸收法1原理原理 蛋白质分子蛋白质分子(fnz)中，酪氨酸、苯丙氨酸和色中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。（即光密度值）与蛋白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键的光吸收值与肽键

35、含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。量的测定。12/5/2021第28页/共36页第二十八页，共36页。 三、蛋白质含量(hnling)测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法（三）紫外吸收法2方法评价方法评价紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度测定后仍能回收使用。低浓度(nngd)的的盐，例如生化制备中常用的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等等和大多数缓冲液不干扰测

36、定。特别适用于柱和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度测定蛋白质浓度(nngd)的变化，而不需的变化，而不需知道其绝对值。知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相该法适于用测定与标准蛋白质氨

37、基酸组成相似的蛋白质。似的蛋白质。12/5/2021第29页/共36页第二十九页，共36页。 三、蛋白质含量测定的其它方法(fngf)（直接法）（三）紫外吸收法（三）紫外吸收法2方法评价方法评价若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的

38、误差。定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注的改变而有变化，因此要注意溶液的意溶液的pH值，测定样品时的值，测定样品时的ph要与测定要与测定标准曲线的标准曲线的pH相一致。相一致。因因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确项操作必须精确(jngqu)控制时间。控制时间。12/5/2021第30页/共36页第三十页，共36页。 三、蛋白质含量测定(cdng)的其它方法（直接法）（四）考马斯亮蓝染色法（四）考马斯亮蓝染色法1原理原理

39、 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在色素结合物在595nm波波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合结合在在2min左右的时间内达到左右的时间内达到(d do)平衡，完成反应十分迅平衡，