药学毕业论文cpgnodn对cpgsodn诱导hpbmc释放tnfα的抑制作用

1、xx大学毕业论文cpg n odn 对 cpg s odn 诱导 hpbmc 释放 tnfa的抑制作用姓 名：2014年6月25日cpg n odn对cpg s odn诱导hpbmc释放tnf a的抑制作用作者：蒋为薇王良喜丁国富余双江【摘要】 目的 明确抑制性cpg odn 208(cpg n odn)对刺激性cpg odn 1826(cpg s odn)诱导单核/巨噬细胞分泌tnf a的影响，为通过拮抗细菌 dna达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法 选用木室前期筛选出的对 cpg s odn活化raw 264.7细胞有抑制作用的cpg n odn,观察其对 cpg sodn诱导hpbm

2、c释放tnf a的影响；应用流式细胞术观察cpg n odn对cpg s odn与hpbmc表面结合和内化的影响。结果 浓度比为1 : 1 的cpg n odn对刺激性cpg s odn诱导hpbmc分泌tnf a具有抑制作 用，并呈一定时效关系；cpg n odn对cpg s odn在hpbmc细胞表面的 结合和内化具有抑制作用。结论cpg n odn对cpg s odn活化hpbmc具 有抑制作用，这个作用可能与其影响hpbmc的表面结合和内化cpg s odn 有关。【关键词】 脓毒症 抑制性cpg odn刺激性cpg odn tnf a表面结合 内 化abstract objectiv

3、e to study the influence of cpg odn 208 (cpg n odn) on tnf a release from hpbmc induced by cpg s odn 1826 (cpg s odn). methods cpg n odn, selected by the previous work in our lab, can inhibit tnf a release from raw264.7 induced by cpg s odn. the influence of cpg n odn on tnf a release from hpbmc ind

4、uced by cpg s odn was measured by elisa. the effects of cpg n odn on the surface binding and internalization of cpg s odn were tested by flow cytometry. results cpg n odn could inhibit tnf a release from hpbmc induced by cpg s odn at the concentration ratio 1 ： 1 in a time dependent manner. cpg n od

5、n could inhibit the surface binding and internalization of cpg s odn. conclusion cpg n odn could inhibit tnf a release from hpbmc induced by cpg s odn, which partly attributed to inhibition of cpg n odn on the surface binding and internalization of cpg s odn.key words sepsis; cpg n odn; cpg s odn; t

6、nf a; surface binding; internalization脓毒症(sepsis)是一种严重创伤和感染的引起全身炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome, sirs),由其发展来的多器官功能不全 综合征(multiple organ dysfunction syndrome, mods)病死率高达 30%50%,但 目前尚无有效的防治措施1。细菌基因组dna(细菌dna)是sirs的主要启 动因子之一。未甲基化cpg的寡核昔酸片段(cpg oligonucleotides, cpg odn) 是细菌dna的免疫刺激作用的最

7、小作用单位，广泛存在于细菌dna中2。 细菌dna之所以被哺乳动物视作异己成分而启动防御反应，是因为其有着与不 如dna明显不同的结构特征：细菌dna屮的cpg二核晋酸出现的频率约为 1/16,而哺乳动物dna中的cpg二核昔酸出现的频率仅为1/64,并且80%发生 甲基化3。研究者们发现只有含有未甲基化cpg为核心的特定六核昔酸序列 的cpgodn才具有刺激性，这些特定的六核昔酸被称为刺激性cpg基序 (stimulatory cpg motif, cpg s odn) 3。krieg 等通过对 adv2 dna> adv5 dna、advl2 dna和大肠埃希菌dna发现部分cpg

8、odn对细胞的刺激活性较 弱，并能对cpg s odn活化细胞有抑制作用，因此推断这些序列可能是中和 性 cpg 基序(neutralizing cpg motif； cpg n odn) 4。由于上述研究中发现 的cpg n odn活性并不稳定，因此在krieg的研究基础上，我们进一步寻找 并得到有效的 cpg n odn： cpg odn 208(5，tgccgcggc aga 3j, cpg odn 208对raw264.7细胞的刺激活性较弱，并对cpg s odn活化的细胞具 有抑制作用。因此，本研究以cpg n odn和cpg sodn共同诱导人外周血 单个核细胞(human per

9、ipheral blood mononuclear cells, hpbmc),观察 cpg nodn对cpg s odn诱导hpbmc分泌tnf a的影响,进一步探讨其可能的 作用机制。1材料和方法1.1材料全硫代修饰的 cpg odn 208(cpg n odn)： 5r tgccgcggcaga 3 由大连宝生物公司合成；全硫代修饰的cpg odn 1826(cpg s odn)： 5r tccctgacgttcctgacgtt 3,和 6 fam 标记的 cpg odn 1826 由上海 博亚生物技术有限公司合成。淋巴细胞分离液购自挪威axis shield公司，比重 1.077orp

10、mi 1640培养液购自hyclone公司，胎牛血清购自paa公司。人tnf a 检测试剂盒购自bioscience公司。实验用移液管，吸管，离心管等玻璃器材均经 260°c高温3h去热原处理；培养板购自bd公司，无热原，一次性使用。1.2 hpbmc的分离按淋巴细胞分离液说明书进行，密度梯度离心法。无菌静脉穿刺采血，肝 素抗凝。在8ml离心管中加3ml淋巴细胞分离液，取5ml抗凝血加到分离液液 面上，2000r/min离心15mino小心吸取中间白膜层，转到新的离心管内，用冷 生理盐水洗涤2次，1500r/min离心6min弃上清，加2m 1 rpmi 1640培养液(含 10%胎

11、牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素)，吹匀制成细胞悬液备用。1.3 cpg n odn抑制cpg s odn诱导hpbmc分泌细胞因子的作用调整hpbmc悬液浓度为lxl06/ml,取0.2ml细胞悬液加于96孔板内，置 3tc co2 温箱培养 2h,同时加入 0、10、20、30、40、50pig/ml cpg n odn 和1 ogg/ml的cpg s odn,每组设3复孑l,另设阳性对照组加入100ng/ml lps, 置37°c继续培养8h,取100卩1上清，所有上清立即进行elisa检测tnf1.4 cpg n odn抑制cpg s odn诱导hpbmc分

12、泌细胞因子的时效关系按上述方法将hpbmc加于96孔板后，置37°c co2温箱培养2h,cpg n odn相对于cpg s odn的时相点分别为2、1、0、1和2h, cpg n odn 和cpg s odn均为10|ig/ml,每组3复孔，另设阳性对照组，0时相点加入 100ng/ml lpso置37°c继续培养8h后取100(11上清测定tnf a。1.5 cpg n odn与cpg s odn预孵对hpbmc分泌细胞因子的影响 实验按上述方法将hpbmc加于96孔板后，置37°c co2温箱培养2h,将一 组 cpg n odn 和 cpg s odn 各

13、 lopg/ml 预孵 2h,另一组的 cpg n odn 和cpg s odn不预孵，直接加入hpbmc中，每组3复孔。置37°c继续培养 8h后取100gl上清测定tnf ao1.6 cpg nod n对hpbmc表面结合cpg sod n的影响调整hpbmc悬液浓度为1 xl06/ml,按每孔0.5ml加入24孔板内，同时加 入1 ogg/ml的cpg n odn和亍6 fam cpg s odn；另设阳性对照：加入 10|ig/ml的亍6 fam cpg s odn；阴性对照：未加任何处理。4°c避光继续 培养30min后取出，釆用流式技术检测。1.7 cpg n

14、odn 对 hpbmc 内化 cpg s odn 的影响调整hpbmc悬液浓度为lxl06/ml,按每孔0.5ml加入24孔板内，同时加 入logg/ml的cpg n odn和56 fam cpg s odn；另设阳性对照：加入 lopg/ml的56 fam cpg sodn；阴性对照：未加任何处理。37°c避光继续 培养2h后取出，采用流式技术检测。所得数据均以土s表示，应用microsoft excel进行统计分析处理，p0.05为 有显著性差异。2结果2cpg n odn抑制cpg s odn诱导hpbmc分泌tnf a的作用加人不同浓度(1050gg/ml)cpg n odn

15、后，当cpg n odn与cpg s odn浓度比为1 ： 1时，hpbmc释放细胞因子的作用受到抑制(p0.05)；而其它 比例剂量时未见抑制作用，但也无协同或相加作用。因此我们在1 : 1的浓度比 条件下研究其量效关系：提前和与cpg s odn同吋给cpg n odn均可抑制 hpbmc分泌细胞因子(p0.05),且抑制效果相当，约为25%；延后给则未见抑制 效应(fig.l)o2.2 cpg nod n与cpg s odn不直接结合和相互作用为观察cpg nodn对cpg sodn的抑制作用是否因为其直接作用引 起，将cpg nodn与cpg sodn进行预孵，如果是直接相互作用引起，

16、则 预孵组的抑制细胞因子释放的效果可能更好。结果显示，cpg s odn预孵与 否对hpbmc释放tnf a没有影响，说明预孵cpg n odn和cpg s odn 对cpg n odn的抑制作用没有影响，cpg n odn与cpg s odn并非直 接结合和相互作用(fig.2)o2.3 cpg n odn抑制cpg s odn在hpbmc表而结合和内化cpg odn与细菌表面接触后被细胞吞噬、内化进入，形成早期内体。早期内体与溶 酶体融合形成晚期krieg等4有关腺病毒dna的研究提示，a亚属的血清型12腺病毒 (adv和c亚属的血清型2、5腺病毒(adv2> adv5),其dna都

17、含有与大肠埃 希菌dna(ec dna)相似频率的未甲基化cpg二核营酸，且均含有较多的 cpg s基序，但却有截然不同的免疫活性：其中adv 12有着与ec dna相似 的刺激性，而adv2和adv5 dna不但无刺激性，还能够拮抗adv 12和ec dna 的刺激作用，在浓度比为1 ： 1的吋候，抑制率可达90%以上。这就提示adv2 和adv5中可能存在一些活性片段，既能抑制adv2和adv5自身所含的cpg s 基序，也能抑制adv 12和ec dna所含的cpg s基序。krieg等4首先报道了抑制性或中和性的基序可以选择性的阻断cpg 介导的免疫刺激，这些抑制性的基序常常富含重复的

18、g或者gc,往往也是甲基 化的。gursel等5, 6的研究也显示cpg nodn可以阻断cpg s odn引 起的有害的thl的活化以及细胞因子的产生，其中一种cpg n odn的结构特 征为cg的甲基化或者未甲基化的gc序列选择性阻断了 cpg引起的免疫活化, 另一种以含有重复的ttaggg序列为特征。klinman等也发现当刺激和抑制性 的基序同时出现在一条单链上时，抑制性基序的作用往往能掩盖刺激性基序的作 用，但抑制性基序如果直接位于刺激性基序的3,端就没有抑制作用7。zhao 等8的研究却提出不是所有的富含gc的都具有抑制活性；stunz等9还 报道cgg和ccg序列虽然含有cpg基

19、序,也具有抑制性。本研究所采用的cpg odn 208(5，tgccgcggcaga 3)是我们通过对 adv2和adv5与advl2、ec dna进行比较，并应用生物信息学技术重新设计 并人工合成的。它含有cpg基序，同时也具有cgg和ccg序列。我们的研究 证实cpg odn 208可以明显地抑制cpg odn 1826的诱导hpbmc分泌tnf a 的作用，这与yamada等10的结果一致。我们还通过预孵cpg n odn和 cpg s odn,排除了 cpg n odn的抑制作用是通过与cpg s odn直接表 面的结合发挥的。在klinman的研究中，cpg n odn并不影响刺激性

20、cpg的表面的结合 和内化，同时stunz等9 也认为cpg nod n抑制cpg s odn的诱导hpbmc 分泌tnf a的作用是通过影响内体的成熟和与刺激性cpg竞争tlr9而发挥, 与影响刺激性cpg的表面的结合和内化无关。但zhu等11发现10|imol/l的 cpg n odn就可以抑制60%的cpg s odn的内化。我们的研究结果显示 cpg n odn不仅影响hpbmc中巨噬细胞对cpg s odn的表而的结合也影 响对cpg s odn的内化，但这可能仅仅是cpg n odn抑制cpg s odn 刺激作用的途径之一。综上所述，cpg n odn可以明显地抑制cps odn

21、的诱导hpbmc分泌 tnf a的作用，该抑制作用部分可能与cpg n odn影响hpbmc对cpg s odn的表面的结合和内化有关。【参考文献】1 zhou h, zheng j, wang l x, et al. chloroquine protects mice from challenge with cpg odn and lps by decreasing proinflammatory cytokine release j . int immuno pharmacol,2004,4:2232 hcmmi h, takeuchi o, kawai t, ct al. a toll

22、like receptor recognizes bacterial dna j . nature,2000,40&740253 britigan b e, lewis t s, waldschmidt m, et al. lactoferrin binds cpg containing oligonucleotides and inhibits their immunostimulatory effects on human b cells j . j immunol,2001,167(5):29214 krieg a m, wu t, weeratna r, et al. sequ

23、ence motifs in adenoviral dna block immune activation by stimulatory cpg motifs j proc natl acad sci usa,1998,95:126315 gurscl i, gurscl m, yamada h, ct al. repetitive elements in mammalian telomeres suppress bacterial dna induced immune activation j . j immunol,2003,171:13936 dong l, ito s, ishii k j, ct al. suppressive oligodcoxynuclcotidcs protect against the development of collagen induced arthritis in mice j . arthritis rheum,2004,50:16867 k