益气化瘀解毒方对人肝癌细胞MHCC97-H迁移能力及趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表达的影响_1

1、    益气化瘀解毒方对人肝癌细胞mhcc97h迁移能力及趋化因子cxcl12、cxcr4、cxcr7表达的影响    郜文辉 曾普华 黄惠勇 叶书林 潘敏求 周芳 李为 刘丹摘要：目的 观察益气化瘀解毒方对人肝癌细胞mhcc97-h迁移能力及趋化因子cxcl12、cxcr4、cxcr7表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 以索拉非尼为阳性对照，cck-8法测定益气化瘀解毒方及索拉非尼对mhcc97-h细胞增殖的作用及最佳作用浓度，划痕实验观察mhcc97-h细胞迁移能力；western blot检测药物干预24 h后cxcl12、cxcr4、cxcr7

2、的蛋白表达。结果 益气化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制mhcc97-h细胞生长，24 h半数抑制浓度分别为0.095 g/ml、10 mol/ml；益氣化瘀解毒方及索拉非尼均有抑制mhcc97-h迁移的能力；经益气化瘀解毒方干预后，mhcc9-h细胞cxcl12、cxcr4、cxcr7蛋白表达量均下降。结论 益气化瘀解毒方能抑制mhcc97-h细胞增殖及迁移，其机制可能是通过下调cxcl12/cxcr4/cxcr7趋化因子轴发挥作用。关键词：益气化瘀解毒方；索拉非尼；人肝癌细胞mhcc97-h；趋化因子doi：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.010：r285.5

3、：a ：1005-5304（2018）07-0041-03abstract： objective to study the effects of yiqi huayu jiedu prescription on the migration ability of mhcc97-h and the expressions of cxcl12， cxcr4 and cxcr7； to discuss its relevant mechanism of action. methods setting sorafenib as a positive control， cck-8 method was u

4、sed for determining the effects of yiqi huayu jiedu prescription on the cell proliferation of mhcc97-h and the optimum concentration. scratch assay was used to observe the migration ability of mhcc97-h. the protein expressions of cxcl12， cxcr4 and cxcr7 were detected by western blot after 24 h of me

5、dicine intervention. results yiqi huayu jiedu prescription and sorafenib can inhibit the cell proliferation of mhcc97-h ， and the inhibitory concentration was 0.095 g/ml and 10 mol/ml at 24 hours. yiqi huayu jiedu prescription can inhibit migration ability of mhcc97-h. the protein expressions of cxc

6、l12， cxcr4 and cxcr7 in hepatocellular carcinoma cells decreased after the action of yiqi huayu jiedu prescription. conclusion yiqi huayu jiedu prescription can inhibit mhcc97-h cell proliferation and migration， which may be realized by down-regulating chemokine axis of cxcl12/cxcr4/cxcr7.keywords：

7、yiqi huayu jiedu prescription； sorafenib； mhcc97-h； chemokines原发性肝癌（以下简称“肝癌”）具有起病隐匿、高度恶性、进展快、预后差和死亡率高等特点。目前临床上肝癌存在大多伴有肝病背景、治疗缺乏针对性、难治性耐药和源头创新药物少等问题。中药复方配伍具有多活性成分、多环节、多靶点的抗肿瘤特点，因此，从中医药寻求多靶点抗肝癌新药可望带来新的突破。本课题组前期研究显示，益气化瘀解毒方可调节免疫、稳定瘤体、抗侵袭转移，对肝癌低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，hif-1）信号通路、肿瘤血管微环境等均有调节作

8、用1-6。在前期研究的基础上，本实验观察益气化瘀解毒方对人肝癌细胞mhcc97-h细胞增殖、细胞迁移及趋化因子cxcl12、cxcr4、cxcr7表达的影响，探讨其相关作用机制。1 材料与方法1.1 药物及制备益气化瘀解毒方（白参、黄芪、莪术、重楼、壁虎等），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院，用10倍温水浸泡30 min，先煎2 h，药渣再加8倍水煎煮2次，每次30 min。将3次煎液混匀，浓缩至200 ml，配制成益气化瘀解毒方母液，浓度为0.5 g/ml。滤纸粗滤，再用0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 保存。使用前稀释为0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g

9、/ml。索拉非尼片，德国拜耳医药保健公司，批号700632，规格200 mg/片。研磨器碾成粉末，称取50 mg，溶于0.5 ml dmso、9.5 ml pbs中，配制成索拉非尼母液（5 mg/ml），0.22 m微孔滤膜过滤分装，-20 保存，dmso终浓度<0.1%。1.2 细胞株mhcc97-h细胞，北京北纳创联生物技术研究院。1.3 cck-8法检测mhcc97-h细胞增殖取生长良好的对数期mhcc97-h细胞，0.25%胰酶消化，重悬，按细胞数为5×103，以100 l/孔接种于96孔板培养。设实验组（100 l不同浓度的益气化瘀解毒方、索拉非尼）、对照组（100

10、l细胞悬液）、空白组（100 l培养液）。培养24 h后实验组加入不同浓度的益气化瘀解毒方（终浓度分别为0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/ml）、索拉非尼（终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50 mol/ml），每次处理5个复孔。孵育24 h后，每孔加入10 l cck8培养14 h，于波长450 nm处测定吸光度（a），去除最高值和最低值后取其平均值，计算细胞增殖抑制率1-（a实验组-a空白组）÷（a对照组-a空白组）×100%，graph padprism6.0绘制增殖抑制曲线，计算半数抑制浓度（ic50）。实验独立重复3次

11、。1.4 划痕实验观察mhcc97-h细胞迁移能力分实验组和对照组进行干预。根据cck-8实验结果确定益气化瘀解毒方、索拉非尼干预浓度分别为0.095 g/ml、10 mol/ml，对照组为正常培养的mhcc97-h细胞。取对数生长期mhcc97-h细胞悬液，以3×105个/孔接种于6孔板，置于培养箱中培养，待细胞贴壁长满90%时，用10 l移液枪头垂直均匀地在6孔板中间划“+”字。pbs冲洗2遍，加入含不同药物的含药培养基和无药物培养基，培养基均不含血清，排除细胞增殖影响。置于37 、5%co2培养，分别于0、24、36 h倒置光学显微镜下拍照，取“+”字上下左右4个点。细胞迁移距

12、离（m）=0 h平均距离-观察时平均距离，划痕平均距离用image proplus计算。1.5 western blot检测趋化因子cxcl12、cxcr4、cxcr7的蛋白表达设实验组益气化瘀解毒方、索拉非尼药物浓度分别为0.095 g/ml、10 mol/ml，对照组为不加药物常规培养的细胞，干预24 h。western blot检测趋化因子cxcl12、cxcr4、cxcr7的蛋白表达。提取细胞，加入蛋白裂解液制备总蛋白，bca法检测蛋白浓度。总蛋白于100 加热变性10 min，取50 g样品上样检测。按说明书配制sds-page胶电泳分离蛋白后，半干式电转膜仪17v，30 min将蛋

13、白转移至pvdf膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，tbst漂洗3×10 min，相关抗体于4 过夜，tbst漂洗3×10 min，加入hrp标记的二抗（15000）室温孵育1 h。tbst漂洗3×10 min后，用电化学发光法显影、定影。利用tanon凝胶成像系统采集图像并进行吸光度检测，以目的条带和内存条带的灰度比值代表该目的蛋白的表达水平。实验重复3次。1.6 统计学方法采用spss17.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析和q检验。检验水准=0.05。2 结果2.1 益气化瘀解毒方对mhcc97-h细胞增殖的影响益气化瘀解

14、毒方浓度分别为0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/ml，其24 h抑制率分别为10.90%、70.69%、93.24%、97.73%，干预24 h ic50为 0.095 g/ml，见表1。索拉非尼浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50 mol/ml，其24 h抑制率分别为27.36%、46.39%、70.89%、96.71%和98.21%，干预24 h ic50为10 mol/ml，见表2。2.2 益气化瘀解毒方对mhcc97-h细胞迁移的影响细胞划痕实验显示，经益气化瘀解毒方、索拉非尼分别处理24、36 h后，细胞划痕较对照组明显变宽。见表3、图1

15、。2.3 益气化瘀解毒方对趋化因子cxcl12、cxcr4、cxcr7蛋白表达的影响经药物干预后，mhcc9-h细胞cxcl12、cxcr4、cxcr7蛋白表达量较对照组均下降（p<0.01）。见表4、图2。3 讨论趋化因子对原发性肝癌的发生、发展及预后起着重要作用。其与受体相互作用能诱导靶细胞趋化性迁移，增强靶细胞与内皮细胞的黏附力等，广泛参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理功能。cxcl12是趋化因子cxc亚家族成员，cxcr4和cxcr7为其同源受体。cxcl12/cxcr4参与多种肝脏疾病的过程，并与疾病的发生、发展密切相关。肝星状细胞通过cxcl12/cxcr4趋化因子轴

16、诱导肝癌细胞侵袭和内皮-间质转化。cxcr4是肝癌增殖和侵袭转移过程中的关键因子之一，与肝癌恶性程度及治疗预后密切相关。肝细胞癌（hcc）中存在hif-1和cxcr7过表达，且cxcr过表达与hcc进展相关。cxcr4和cxcr7可激活erk/mapk、pi3k/akt/mtor、jak/stat3等信号通路，促进恶性肿瘤的进展。益气化瘀解毒方是根据肝癌“虚、瘀、毒”的基本病机，经病证结合、精准配伍而成的临床效验方。该方以白参、黄芪等益气健脾，莪术、石见穿、壁虎、鳖甲等化瘀散结，重楼、半枝莲等清热解毒，全方共奏益气化瘀解毒之功。本研究结果显示，益气化瘀解毒方可抑制mhcc97-h细胞迁移，其作

17、用可能与调节cxcl12、cxcr4、cxcr7等趋化因子表达有关。参考文献：1 曾普华，郜文辉，潘敏求，等.益气化瘀解毒方加减联合鸦胆子油乳经血管介入治疗中晚期原发性肝癌的临床研究j.辽宁中医杂志，2013， 40（1）：18-20.2 郜文辉，曾普华，潘敏求，等.益气化瘀解毒方含药血清对鸡胚尿囊膜血管生成的影响j.中华中医药学刊，2013，31（1）：19-20.3 曾普华，郜文辉，潘敏求，等.益气化瘀解毒方药对人肝癌hepg2细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响j.现代肿瘤医学，2014，22（1）：8-11.4 曾普华，郜文辉，潘敏求，等.益气化瘀解毒方及拆方对人肝癌裸鼠hepg2移植瘤mvd、hif1a、vegf/kdr表达的影响j.中华中医药学刊， 2014，32（7）：1563-1565.5 曾普華，郜文辉，潘敏求，等.益气化瘀解毒方及其单味药对人肝癌hepg2裸鼠移植瘤血管拟态相关因子的影响j.中国中医药信息杂志， 2015，22（2）：55