如何获取高质量的显微镜照片

1、如何获取高质量的显微镜照片在原代细胞培养过程中，一张好的照片胜过千言万语。优质的照片可以传递细胞 的形态、健康状况、纯度和密度。如果同吋使用不同类型的2维显微镜技术，如 相差、浮雕对比和荧光显微镜等，可以为你所培养的细胞提供有价值的认识。相差显微镜通过将细胞的厚度转化成灰度级，增强了对比度。细胞的较厚区域， 如细胞核，比细胞浆等较薄的区域更暗。这种技术对于评估细胞形态和培养中的 纯度观察很有用。它也可以指明细胞的健康状态，如细胞质变暗，提示细胞可能 受损或死亡。human epidermalhuman hepatic sinusoidalhuman oralkeratinocytes (cat

2、 #2120) endothelial cells (cat #5000) fibroblasts (cat #2640)图1相差显微镜下人的角质细胞、内皮细胞和成纤维细胞形态的不同之处。浮雕对比度显微镜（也称为霍夫曼调制对比）呈现了一个阴影伪浮雕效果，它也 可以用来评估培养的细胞的形态和纯度。它特别有助于区分那些不同的细胞类 型，如更扁平的细胞（如成纤维细胞）与更厚的、更圆的细胞（如上皮细胞）。 如图2所示。human gingivalhuman bronchialfibroblasts (cat #2620)epithelial cells (cat #3210)figure 2与此相反，

3、荧光显微镜使用紫外（uv）光激发/发射滤波器选择性地激发和显示 荧光。它可用于观察荧光蛋白的细胞或免疫荧光染色的结果。免疫荧光染色使用 荧光标记的抗体与目的蛋口特异性结合，可用于检测细胞的特异性标记物，这也 是评估培养细胞纯度的最佳方法之一。图3演示了如何用免疫荧光染色鉴定细胞类型和培养纯度。第1张图显示了儿个p-tubulin iii阳性的神经元在两个dapi 阳性细胞核（红色箭头）的非神经元细胞中间。第2张huvec图像显示的是 个纯度很高的培养细胞，广泛的表达内皮细胞的标志物cd31o第3张图像为 人类星形胶质细胞，纯度也很高，标志物gfap阳性染色分布广泛。rat hippocampa

4、lneurons (cat #r 1540)human umbilical veinendothelial cells (cat #8000)humanastrocytes (cat #1800)nucleusnucleus gf apfigure 3虽然这些显微镜技术提供了不同方面的信息，联合使用这三种显微镜技术来观察 你所培养的细胞状态和纯度，是获取细胞状态的有效方法。拍摄高质量图片的技巧为了获取高质量和真实的显微镜图片，这些基木要素需要被考虑：显微镜配置, 焦距和曝光。显微镜的配置首先要充分了解显微镜的使用情况。如果是新手，要请有经验的人示范正确的使 用方法，或是在使用前认真阅读说明书。

5、显微镜有许多可移动部件，哪怕其中一 处设置错误，都可能会影响所拍摄图片的质量。熟练掌握显微镜的不同设置，并 能根据需要选择合适的光路，将大大有助于解决使用过程中可能遇到的各种问 题。焦距清晰的焦点是好图像的最重要特点，但却并不容易实现。虽然细胞在体外通常生 长在二维表而上，但实际上细胞是三维的。那应该聚焦在细胞的哪个区域呢？ 对丁-使用相差和浮雕对比相差这类利用透射光线来观察整个细胞，通常理想的状 态是聚焦在最薄的部分（图4a）而不是在胞体上（图4b） o为了做到这一点， 可以一边观察细胞边缘，一边调整微调旋钮，直到边缘变得锐利。在荧光图像中, 在核染色（通常是蓝色的hochst或dapi）窗

6、进行聚焦，同时比细胞浆或粘附 蛋白的聚焦效果好。聚焦后再用每种颜色进行微调，能确保感兴趣的颜色区域 是锐利的。这将保证一旦颜色被合并，能得到完全清晰的图像。figure 4曝光 曝光与图像中所能捕获的光的强度相关。对于相差和浮雕对比度的控制，可以通 过调节透射灯的强度，或在软件中调整曝光时间来实现。过强的曝光会导致图片 饱和度过高或过于明亮，从而缺少光强的变化（图5）。而太低的曝光将难以显 现细胞（图5）goodtoo darktoo brightrat brain microvascular endothelial cells (cat #r1000)figure 5曝光对于荧光成像尤为重要，这可以通过图像捕获软件进行控制。最终的冃标是 获取一个很强的信号，但其强度却又至于过于饱和（图6） o成像软件可以用来 调整图像对比度，并减少背景荧光，但这首先要保证一个合适的信号强度。不过, 不能应用成像软件来降低饱和度。值得注意的是，你不能过度处理图像，从而歪 曲了其原型。rat hippocampal neurons (cat #r1540) betii-t