张宣琪土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定

1、张宣琪土壤中产淀粉酶芽砲杆菌的筛选与鉴定土壤中产淀粉酶芽砲杆菌的筛选及鉴定广州人学生命科学学院姓名：张宣琪班级：生技121班学号：1214300094同组组员：徐婷婷刘海伦张黎明崔仁洪叶毅航1一、摘要本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽砲杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株 的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰式细菌学手册鉴定其种属。实验屮通过80°c水浴20min预处理，杀死无芽砲菌体，筛选出芽抱杆菌；再川稀释涂布 平板法对芽砲杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用 选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽他杆菌。最后并通过耐盐

2、试骑、明 胶试验、糖发酵试验、vp试验、口引味试验等多项牛理牛化实验对筛选出來的菌种进行鉴 定，鉴定结果为蜂房芽抱杆菌。二、关键词：淀粉酶芽鞄杆菌 生化鉴定三、实验材料与方法1、实验材料1.1 土样的采集选取广大梅苑公寓楼下花园、广大生化楼前小河附近两处的土壤，五点法采集，边长 15cm。铲去表层土，取10cm深十壤，每一个十样约25g左右（每个点5g）。将十样放入 无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型,4 °c冰箱中保存备用。分别记做a 土 样、b 土样。1.2培养基淀粉筛选培养基淀粉20 g,蛋白豚10 g, nacl 2.5 g,琼脂10 g,自来水1000 ml,

3、ph自然。斜面种了培养基牛肉膏3 g,蛋白豚10 g, nacl 5 g,琼脂1520 g,自来水1000 ml, pl i 7. 27.4；蛋白腺液体培养基（作口引味实验用）蛋白jj东 10 g, nacl 5 g,自来水 1000 ml, ph 7. 27. 4, 121°c 灭菌 20 min；2葡萄糖蛋口豚培养基（vp和mr试验用）蛋白月东5 g,葡萄糖5 g, nacl 5 g,自来水1000 ml, ph 7. 27. 4, 121°c灭菌20 min；糖发酵培养基（作糖酵解试验丿id蛋白月东2 g, nacl 5 g, k2iipo4 0.2 g, 1%滉麝香

4、草酚蓝水溶液3 ml,待试糖10 g（ 般糖或醉按1 %量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 %的量加入），自來水1000 ml, ph 7. 27. 4；酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用）l酪氨酸05g悬浮于10ml蒸馆水中,20分钟灭菌,然后于100讥无菌的营养琼脂混 介，即成酪氨酸水解平板；酪索平板（作酪素水解试验用）取5g脱脂奶粉加入50ml蒸傳水中（或用50ml脱脂牛奶）,另称1. 5g琼脂溶于50ml 蒸係水中，将两液分开灭菌。待冷至45 50°c时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板；西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用）柠檬酸钠 2 g, nacl 5 g, mgs04

5、7h20 0.2 g, k2hp04 3h20 1 g, （nh4） 2hp04 1 g, 1%混麝香草酚蓝水溶液10 ml,琼脂1520 g,自來水1000 ml, pl i 7.0 , 121°c灭菌 20 min；淀粉牛肉音蛋白豚琼脂培养基可溶性淀粉2 g,牛肉膏3 g,蛋白腺10 g, nacl 5 g,琼脂1520 g,蒸饰水1000 ml, ph 7. 27. 4；（2%、5%、7%）高盐培养基（做耐盐试验用）3牛肉膏3 g,蛋白淼10 g, nacl （ 2g. 5g、7g）,琼脂1520 g,蒸谓水1000 ml, ph 7. 27. 4；明胶培养基（做明胶液化试验用

6、）牛肉膏3 g,蛋白丿冻10 g,明胶12g,蒸憾水1000 ml , ph 7.0；半固体培养基（作运动性实验用）琼脂含量0. 5%,其他组分比例按牛肉膏蛋白腺培养基配制；1. 3试剂和仪器1.3. 1试剂耐盐性试验：nacl粉末。糖酵解实验：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。革兰氏染色：草酸钱结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。芽泡染 色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。v. p试验（mr试验）：40%na0h溶液，奈酚。ii引卩朵试验：乙腿郦试剂。碘原液：碘llg,碘化钾22g,加水定容至500mlo单染色：草酸讓结晶紫或石炭酸复红。硝酸盐试验：卬液（对氨基苯磺

7、酸0. 8g+5mol/l醋酸100ml；乙液（a-奈胺0.+5mol/醋酸 looml）:酪素水解：脱脂奶粉。酪氨酸水解：i厂酪氨酸。4溶菌酶抗性实验：溶菌酶。卵黄反应：新鲜鸡蛋。硝酸盐试验：硝酸盐明胶液化试验：明胶柠檬酸盐利用试验：西蒙斯氏柠檬酸盐1.3.2仪器：无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水 纸，涂布器，显微镜，移液管，移液枪等。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，恒温水浴箱，磁力搅拌器等。2、试验方法2. 1 土壤样品悬液制备2.1.1 土壤悬液制备各称取5 g 土壤样品于装有45ml无菌水的100ml.锥形瓶屮，加入玻璃珠与

8、十壤悬液一 起振荡，制成土壤悬液。置100°c沸水浴10 min,以杀死非芽砲杆菌。静置5min。2.1.2 土壤悬液稀释吸取上清液0. 5 ml加到含有49. 5 ml无菌水的三角瓶中，配成10 - 2 g/ ml的土壤 悬液，并进一步稀释至10 - 3g/ ml x 10 - 4g/ ml和10 - 5g/ ml,共四个浓度梯度。2. 2分离纯化2.2. 1芽他杆菌属的纯培养分别吸取不同稀鏗度的土壤悬液0. 2 ml于牛肉膏蛋白月东琼脂平板上，用无菌玻璃涂棒 涂布均匀。每个稀释度3个重复,37 °c倒置培养24h。每个土样挑5取形态特征不同的单菌落，在牛肉膏蛋白豚琼脂平

9、板上划线纯化。菌落的形状、颜色、 质地、透明度一致，菌体形态为直杆状，长度均一、宽度一致，并能产牛芽孑包时，确认为芽抱 杆菌属的纯培养物。2. 2. 2产淀粉酶菌株的筛选淀粉水解实验挑取菌种，划线接种于可溶性淀粉培养基屮，每种菌株做一个平板，将接种完成的平板 置于37°c恒温箱中倒置培养24ho2. 2. 3单染色镜检步骤：涂片、十燥及固定；染色：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸鞍结晶紫染色液或石炭酸复红液，染1 min,倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止。镜检：用油镜观察染色结果；2.2.4芽他染色镜检步骤：取37°c培养1824h的枯草芽抱杆菌涂片，十燥，固定。于涂

10、片上滴人35滴5%孔雀绿水溶液。用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，口载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约 4-5mino加热过程中切勿使染料蒸干，必要时对添加少许染料。倾去染液，待玻片冷 却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。用石炭酸复红液复染1 min,水洗。制片干燥后用油镜观察。芽抱呈绿色，菌体红色。观察芽抱的形状和位置.2. 2. 5菌株保藏将筛选出的菌株接种于肉汤琼脂斜面，4下保存待用。2. 3初步鉴定2. 3. 1形态学鉴定将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽砲杆菌菌6落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味 等。然后进行一系列的

11、镜检革兰氏染色、芽袒染色（具体步骤同上）观察是否符合芽 砲杆菌的指标。2. 3. 2生理生化鉴定温度对微生物生长的影响将牛肉膏蛋口腺培养基融化倒平板（培养基厚度为15-20cm）。使用牛肉膏蛋口月东培养 基，将菌株十字接种到平板，分别在5°c、15°c、20°c、25°c、30°c、35°c、40°c、 45°c、50°c、55°c、60°c、65°c条件下培养24h,观察细菌是否生长。糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）取斜面培养菌种接种于37°c温箱中

12、培养24h,观察培养基是否由紫变黄，杜氏小管中是 否有气泡，以证实菌株是否产酸产气。vp试验取葡萄糖蛋门丿陈培养基，接种37°c培养两天，取出以上试管，每管分别加入40%na0ii 溶液10-20滴，并加等量a-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37°c恒温箱中保 温15-30min后，若培养液呈红色，记为阳性（+ ）反应，若不呈红色，记为阴性（-）。mr试验取葡萄糖蛋白腺培养基，接种37°c培养两天，取出以上试管，每管分别加入甲基红2 滴，震荡，若培养液呈红色，记为阳性（+ ）反应，若不昱红色，记为阴性（-）。ii引喙试验取蛋白豚水培养基,接种，37度培养2

13、天，在培养基中加入乙储12ml,经充分振荡使 眄i味萃取至乙醯中，静置片刻后乙醸层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴 引味试剂，如有口引味存在,乙瞇层呈现玫瑰红色,为呵味试验阳性（+ ）,否则为阴性（- ）。7柠檬酸盐利用实验取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜而的试管，分别将少量菌苔接种于各支相应的管中， 然后置于37°c恒温箱中培养24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸 盐作为碳源而生长，即为阳性（+）,若培养基无变色，则为阴性（-）o耐盐性试验将分离获得的细菌分别接种在nacl浓度为2%, 5%, 7%, 10%,的牛肉膏蛋白腺液体培养 基中，置37

14、76;c下培养，观察生长情况，并做记录。硝酸盐还原实验被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35°c培养14d.将甲、乙液等量混介后（约0.1 mb）加入培养基内，立即观察结果。明胶液化试验穿刺接种，深度至明胶层2/3处，于37°c温箱培养24h.。取出静置冰箱中待其凝固 后，再观察其是否被细菌液化，如被液化，则为阳性，能产生蛋白酶。运动性试验使用半固体营养琼脂试管，将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底广1.5cm处，沿原穿刺线拔出接种针。于37°c温箱培养24h,观察是否产生树根状生长，若 有，则菌株有鞭毛，若直立生长，则菌-株无鞭毛。酪素水解试验（酪蛋白水解

15、）牛奶平板的制备:取5g脱脂奶粉加入50ml蒸憾水中（或用50ml脱脂牛奶），另称 l5g琼脂溶于50ml蒸饰水中，将两液分开灭菌。待冷至4550°c时，将两液混匀倒平 板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每iiil 可点接3-5株菌。37°c培养，记录菌落周围和下而酪素是8否已被分解而呈透明。酪氨酸水解实验将营养琼脂融化，冷却至温热，与l-酪姐酸混匀，分别将菌种点接在平板上，37°c培养 24h。记录菌落周围是否有透明圈，若有，则菌株能够水解酪氨酸。卵黄反应试验步骤：取18-24h的斜而或培养液中的菌体点种在上述平板上，点的

16、直径约为2-3mm0每 个平板可分散点5-7株菌，以不影响观察为宜，适温培养18-24h观察。如菌落四周和下 而有不透明的区出现，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。淀粉水解试验用18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂平板（一个平板可分区划“+ “字接 种，），于37°c培养24-48ho然后将碘试剂完全浸于培养表而。立即检视结果，阳性反 应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或菌苔周用出现无色透明环。阴性反应则 无透明环。0. 001%溶菌酶试验将菌种制成菌悬液，用无菌玻璃涂棒涂布在牛肉音蛋白腺琼脂培养基上,然后用在溶菌 酶试剂中浸湿的滤纸片贴在平板上，培养24h后观察

17、有无抑菌圈的出现，若有为阳性反 应，否则为阴性反应。2. 4菌种鉴定根据从们杰式细菌学手册芽抱杆菌属中检索到的芽孑包杆菌的匸理生化特点，选取能从土 壤屮分离到的芽砲杆菌种为标准菌种，具生理生化指标如下表：通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从而鉴定出u的 菌的种別；四、实验结果分析1、分离纯化1.1菌株的初筛1. 1. 1通过80°c水浴20min分别对ab 土样进行预处理，杀死无芽他菌体。革兰氏耐盐vp明胶运动硝隹枯草芽宛杆菌+-地衣芽范杆菌+十+蜻状芽總杆菌+(at巨大芽宛杆菌+十+(多粘芽砲杆菌d+坏状芽砲杆菌d凝结芽鞄杆菌+d+(蜂房芽砲杆菌d+坚硬

18、芽鞄秆菌+短芽抱杆菌d差大+(球形芽孑旬杆菌d+巴氏芽西杆菌d十1伯杰式手册芽總秆菌属生理生化鉴定表2 a i 、i i 、i 、i i酪氨酸葡糖木糖阿糖甘露醇产气最高温枯草芽宛秆菌+-45-55地衣芽鞄杆菌1 十+十+-50-55蜡状芽鞄秆菌+*-35-45巨大芽鞄杆菌d*十www-35-45多粘芽孑包秆菌+十35-45坏状芽狗杆菌11-35-50凝结芽鞄秆菌ww-55-60蜂房芽泡秆菌d+-35-45坚硬芽泡杆苗dwww+-40-45短芽翹杆菌+d-w-40-60球形芽泡杆菌-30-45巴氏芽殉秆菌-33-42阳性:+;阴性;阳性和阴性不稳定:d;弱阳性：叭101.1.2把处理过的菌悬液离

19、心取上淸液，稀释到不同梯度，每个梯度分別涂布到营养琼 脂培养基，27°c保温箱培养24h,获得氏有不同菌落的培养基。用接种环挑取8个菌落形 态不同的单菌落于筛选培养基中进行分区划线，划线结朿后，置于在37 °c下恒温培养 1224h,每过12、24h重复此操作共3次。分别通过3次分区划线，分离纯化初筛所得到 的8株菌，把这些菌进行编为广8号。1.1.3把这8株菌接种到淀粉培养基中，筛选出能产淀粉酶的菌株，结果只有1、2、3、4号株菌有透明圈；5号菌有一个平板没有接种到，为了实验准确性，放弃5号；6、 7、8号菌均未产生透明圈，即不产淀粉酶，不符合冃标菌株要求，放弃。1.2菌

20、株的复筛1.2. 1单染色经单染色镜鉴，2号菌株不是纯培养，有杂菌s不符要求；1、3、4菌株鉴定为纯培 养，符合耍求。（3号菌株单染色）1.2.2芽泡染色经芽泡染色镜鉴，观察到1、4号菌株无芽他，3号菌株有芽彳包，芽他中生，菌株比较年 轻，是芽砲杆菌。11（3号菌株芽砲染色）1.2.3革兰氏染色对3号菌株进行革兰氏染色，被染成红色，是革兰氏阴性菌。最终得到能产淀粉酶的芽砲杆菌，把菌株接种到斜面培养，保存菌株。2初步鉴足2.1形态学鉴定3号菌的形态特征：乳门色，湿润，不透明，菌落较厚，整体突起，表面粗糙，菌落边 缘不整齐凹凸不平，菌落较粘稠，像鼻涕一样不容易被挑起。2. 2牛:理生化鉴定温度对微

21、生物生长的影响5°c> 50°c、55°c、60°c、65°c不长菌，15°c、20°c、25°c、30°c、35°c、40°c、45°c 长菌，11 20-40长势较好。3号菌比较适宜的半长温度大概是20-45°c的范围。123号菌株不同温度下的生长情况）13 (糖类发酵试验（衙萄糖、木糖、阿拉伯糖、卄霭醉）木糖、阿拉伯糖、甘露醇均为阴性，葡萄糖：24h,阴性；48h,变成黄色，布氏小管无气 泡，记作“ + ”。3号菌能利用葡萄糖，且反应产酸不产气。3号菌株

22、葡萄糖发酵试验）3号菌株木糖发酵试验）3号菌株口露醇发酵试验）14（3号菌株阿拉伯糖发酵试验）vp试验37°c培养12h之后，每管分别加入40%naoii溶液15滴，并加等量a -奈酚，振荡试 管，置37°c恒温箱中保温30n）in后，培养液呈红色，记为阳性（+ ）反应，说明3号细菌 能分解葡萄糖产生丙酮酸。mr试验（3号菌株vp试验）37°c培养12h,取出试管，每管分别加入甲基红2滴，震荡，培养液不呈红色，记为阴 性（-）o（3号菌株mr试验）15眄際试验37°c培养12h,加入乙醛ind,经充分振荡使口引味萃取至乙醛中，静置片刻后乙醛层浮于 培养液

23、的上谢，此时沿管壁缓慢加入10滴卿味试剂，乙瞇层呈现玫瑰红色，为眄i味试验 阳性（+ ），即有u引喙存在。（3号菌株眄|味试验）淀粉水解试验37c培养12,然后将碘试剂完全浸于培养表血。立即检视结果，琼脂培养基呈深蓝色、 菌落或菌苔周围出现无色透明环，是阳性反应（+ ）即淀粉被分解，3号菌能产淀粉酶。（3号菌株淀粉水解试验）耐盐性试验置37°c下培养12h,四个浓度梯度的高盐培养基都长菌了，其情况可表示为：2+, 5+卄，7+, 10+ （+表示菌落数冃、人小）说明3号菌耐盐能力较高。16（3号菌株耐盐试验）运动性试验于37°c温箱培养12h,观察到没有产生树根状生长，是直

24、立生长，说明该菌株无鞭毛。酪索水解试验（酪蛋白水解）37°c培养12h,记录菌落周围和下面酪素已被分解而呈透明，说明该菌株能水解酪素。 其透明圈的大小分别如下表：编号123透明圈大小（cm）2. 52.61. 7透明圈大小（cm）2. 42. 12. 2（3号菌株酪素水解试验）17酪氨酸水解实验37c培养12h,两个实验培养基，长满了成片的菌；空门对照培养基也长菌。培养基被污 染。污染原因是酪素灭菌时报纸破了一点点，受到轻微污染。卵黄反应试验适温培养24h观察菌落四周和下面没有不透明的区出现，反应为阴性（一）,表示卵磷 脂没冇分解牛:成脂肪，没冇卵磷脂酶。柠檬酸盐利用实验置于37&#

25、176;c恒温箱中培养24h,培养基变蓝色，为阳性（+ ）,表明该菌能利用柠檬酸盐 作为碳源而生长。硝酸盐还原实验37°c培养14d,将a （横胺酸冰醋酸溶液）和b （a-蔡胺乙醇溶液）液等量混合后 （约0.1 ml）加入培养基内，无明显变化，为阴性（一）。说明3号细菌不具有还原硝酸 盐的能力。明胶液化试验穿刺接种，深度至明胶层2/3处，于37°c温箱培养12h. o取出静置冰箱中待其凝固 后，观察到被细菌液化，为阳性（+），说明3号菌能产生蛋白酶。0. 001 %溶菌酶试验培养12h后观察无抑菌圈的出现，为阴性反应。3菌种鉴立通过形态学鉴定，革兰氏染色、运动性试验、耐盐试

26、验、温度试验、柠檬酸盐试验、硝 酸盐还原试验、酪氨酸水解试验、酪素水解试验、糖发酵试验、vp试验、ii引味试验、明胶 水解试验、0.001%溶菌酶试验等生理生化实验，对筛选得到的菌种各项生化指标进行测 定，对照伯杰式细菌学于册的检索样式，对实验18原始数据进行分析，3号菌株生化鉴定结果-与芽砲杆菌属，蜂房芽砲杆菌的各项生理4： 化指标相同。最终初步鉴定结果为：3号菌株最有可能为蜂房芽抱杆菌。本实验在菌株鉴定方血不够全血，除了形态学鉴定、生理生化鉴定，应该再做分子生物 学（dna）方而的相关鉴定才可以确定菌株的种属。五、实验讨论1、分离纯化木次实验的分离纯化，进行了涂布、划线培养、淀粉培养基筛选

27、培养、单染色、革兰氏 染色、芽孑包染色等步骤，耗时较长，但还是比较顺利的。1.1涂布，不同稀释倍数的菌悬液含菌量有较大差异，10 - 2 g/ ml菌过多，难得得到 易取的菌落，10 - 5g/ ml几乎没有菌，10 - 3g/ ml . 10 - 4g/ ml比较合适。町作为 实验经验用于以后的实验操作中。1. 2划线培养，一共进行了 3次划线，每次培养时间均为12h,得到的菌落从后期的实验 检验结果來看，得到的但菌落情况比较理想。划线过程屮，我的操作由生疏到熟练有了很 大的进步，无菌操作也越来越好。1.3淀粉培养基筛选培养，木组方案设计中，先进行“产淀粉酶”的菌株筛选，很大程 度上减轻了实

28、验压力。实验结束之后，顿悟我们可以先筛选产淀粉酶的菌株再获得纯培养，按照我们组的实验 情况（有二分z的菌株能产淀粉酶）估计，我们可以极大程度上提高实验效率。我们组 分离纯化的过稈，与同学对比，实验操作中的失谋很少，污染控制很好，配合好，效率高 效果好。2、生化鉴定本次实验对菌株进行了多项生理生化实验，其中像糖酵解、vp、mr等鉴定项冃，以前的 实验屮接触过，所以比较了解，操作顺利，结果也很理想；但是像卵黄试验、溶菌酶试验 等第一次接触，因为对培养基制备、反应原理等方面的不熟悉，所以真的花了很多功夫在 这上血：酪氨酸实验被污染，因为是50也的锥形瓶，报纸包的比较少、比较薄，灭菌z 后报纸破了一点

29、点，实验后培养基全部被污染，真的实验当中一点点污染都不能存在；溶 菌酶实验操作是出现问题，直接吧溶菌酶加到培养基中，比例不符，并不能看到抑菌圈现 象。实验过程屮源于19我们的合理分工和互相配合，效率很高，是两个班中最快完成所有实验的。3、实验心得本次微生物大实验真的和原来的任何一次实验都不一样，从实验设计到实验操作，从实 验准备到试验后的清理工作，每个步骤完完全全都是由我们自己完成，虽然很辛苦，但是 也正是因为每个步骤都耍我们独立完成，真的学习到很多东西，各方面冇了较大提升。在微生物理论方血：一方面，用实验的方法对自己所学的理论知识做-个巩固，加深了 印象，有了更深入的理解；另一方而，每次遇到

30、不懂的东西，自己都会独立的运用课本、 文献去探究，爱化了自主学习能力，而且现在也不会排斥文献了，反而觉得查文献是个好 方法。在实验操作方面，强化了口己科学高效的设计、开展实验的能力，捉高了口身的实验技 能。当拿到一个课题的时候，实验设计无疑是一个难题，要查阅很多资料，尽可能优化简 化实验；要考虑平行、对照等实验原则；甚至要注意什么时候用平板什么斜而这样的问 题，而而俱到，细心谨慎。进行实验的时候，无菌操作是绝对的重点，由于实验条件的限 制，对我们操作的要求就更高了，一个不经意的动作很有可能带来污染，甚至导致前期的 很多工作前功尽弄。对于实验技能，我觉得没有人量的操作练习真的很难做好，刚开始实 验的时候，单是一个接种就能状况百出，无菌室中一会打烂平板、一会烫到手、一会又是 烧到棉塞，所以现在不管是配制培养基、倒平板，还是划线接种，甚至刷试管、洗平板， 能够做到很熟练很顺畅的进行这些操作，真的我自己也会觉得很骄傲，付出了很多。原來 会觉得实验室里面的很多