微生物检验方法验证方案(4)

1、.药品微生物限度检查方法验证方案微生物控制菌检查方法 片验证方案微生物限度检查方法验证方案13微生物检验方法验证方案22药品微生物限度检查方法验证方案*;方 案 审 批1方案起草起草部门签名日 期质量控制部 年 月 日2方案会签部 门签 名日 期QC部长 年 月 日微生物检验员 年 月 日 QA部长 年 月 日3方案批准批 准 人签 名日 期质量负责人 年 月 日4方案实施实施部门职 责质量控制部对验证工作与检验相关的数据的采集与检验验证方案、报告的编写质量保证部负责验证方案和报告的审核对人员进行培训文件进行整理归档质量负责人对验证工作全面主持批准验证方案和报告微生物检验员方案具体实施，并出具

2、检验记录和报告 目 录1. 概述2. 仪器设备3. 供试液的制备4. 细菌、霉菌及酵母菌计数5. 控制菌检查6. 验证品种项目表微生物限度检查法概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。除另有规定外，本检查法中细菌的培养温度为3035，真菌、酵母菌的培养温度为2

3、528，控制菌培养温度为（36±1）。检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml为单位报告。检验量即一次试验所用的供试品。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的三倍量供试品。2 仪器设备2.1 YXQ-LS-30SII型立式压力蒸汽灭菌器2.2 双人净化工作台 2.3 150A型培养箱2.4 HH.B11-500型培养箱2.5 202-2型干燥箱2.6 微波炉2.7 架盘天平2.8 YJA-电动匀浆仪3 供试液的制备根据供试品的理化特征与生物学特征，可采取适宜的方法制

4、备供试液。供试液制备若需要用水浴加热时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。液体供试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。固体供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10供试液。4 细菌、霉菌及酵母菌计数 4.1 计数方法的验证：当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。无特殊情况下，验证周期为一年

5、。 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。4.2 菌种及菌液制备4.2.1 验证用菌株：试验用菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特征。验证菌株培养基培养温度培养时间大肠埃希菌CMCC(B)44102营养肉汤303518-24h金黄色葡萄球CMCC(B)26003营养肉汤303518-24h枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501营养肉汤303518-24h白色念珠菌CMCC(F)98001改良马丁琼脂培养基232824-48h黑曲霉菌CMCC(F)98003改良马丁琼脂培养基232

6、85-7天4.2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于3035培养1824小时。取经3035培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-610-7约为50100cfuml的菌悬液备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于2328培养2448小时。取经2328培养2448小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50100cfuml的菌悬液备用。接种黑曲霉菌的新鲜培养物至

7、改良马丁琼脂斜面培养基上，于2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfuml的菌悬液备用。4.2.3 每ml菌液含菌量的计数测定 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml已经过适用性检查确证的温度不超过45的相应的溶化的培养基，混匀，凝固，倒置培养。每个稀释级至少制备2个平板。细菌类别培养

8、温度为3035，培养3天；霉菌、酵母菌类别培养温度为2328，培养5天。4.3 验证方法：验证试验至少应进行三次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4.3.1 试验组：平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。4.3.2 菌液组：测定所加的试验菌数。4.3.3 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底

9、菌数。4.3.4 稀释级对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每毫升供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。4.4 结果判断：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的均回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉

10、菌及酵母菌数；若任一次试验中验证组的回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合适用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么验证试验中微生物回收的失败可看成时因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对试验用的菌株具有抑制作用，对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检查结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验

11、。计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。验证试验液可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 控制菌检查方法的验证：当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。无特殊情况下，验证周期为一年。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。菌种

12、及菌液制备 验证用菌株试验菌株培养基培养温度培养时间（小时）大肠埃希菌 CMCC(B)44102营养肉汤30351824金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003营养肉汤30351824乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094营养肉汤303518245.2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。每ml菌液含菌量的计数测定。 每ml菌液含菌量的计数测定测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml已经

13、过适用性检查确证的温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。培养温度为3035，培养3天。5.3 验证方法5.3.1 试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入赠君培养基中。5.3.2 阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌，阴性对照菌不得检出。5.4 结果判断：阴性菌

14、对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合适用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 验证品种项目表以上品种含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定真菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。附：细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证原始记录控制菌检查方法验证原始记录第 7 页 共 9页 通化金汇药业股份有限公司 海量资料 超值下载细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证原始记录 文件编

15、号：SOP.PC-JT-23-01-02品 名规 格批 号数 量来 源检验日期年 月 日检 验 依 据中国药典2010年版一部报告日期年 月 日紫外消毒时间时 分 时 分 记录编号试验用培养基：培养基名称批号培养基名称批号营养琼脂培养基营养肉汤培养基玫瑰红钠琼脂培养基改良马丁琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）一 试验组：营养琼脂培养基 （大肠埃希菌）营养琼脂培养基 （金黄色葡萄球菌）营养琼脂培养基 （枯草芽孢杆菌） 碟号检品12平均 碟号检品12平均 碟号检品12平均1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液501

16、00 cfu玫瑰红钠琼脂培养基（白色念珠菌）玫瑰红钠琼脂培养基（黑曲霉）YPD培养基（白色念珠菌） 碟号检品12平均 碟号检品12平均 碟号检品12平均1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu二 菌液组：取上述试验菌液，测定其加入的试验菌数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均 三 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落记数方法测定供试品本底菌数细菌总数检查标准规定：不得过 cfug或ml 霉菌、酵母菌总数检

17、查标准规定不得过 cfug或ml取样量：每一浓度吸1ml取样量：每一浓度吸1ml营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均2平均结果CFUg或ml碟号稀释液12平均结果CFUg或ml10-110-110-1原菌液阴性对照阴性对照阴性对照四 稀释剂对照组：取稀释剂1ml加入50100 cfu试验菌，注皿经培养测定其菌数碟号稀释液菌种12平均PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念球菌黑曲霉五 计算试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数试验菌组的回收率（%）= _ ×100%菌液的平

18、均菌落数 菌种代数菌液组（cfu / ml）试验组（cfu / ml）供试品对照（cfu / ml或g）人工染菌回收率（%）大肠埃希菌细菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌霉菌、酵母菌白色念珠菌（YPD培养基）黑曲霉 稀释剂对照组平均菌落数（2） 稀释剂对照组的菌回收率（%）= _×100% 菌液的平均菌落数 菌种稀释剂对照组平均菌落数菌液的平均菌落数回收率（%）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉六 结果判定：稀释剂对照组的菌回收率：试验菌组的菌回收率：若稀释剂对照组和试验菌组的菌回收率均不低于70%，确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。_

19、检验人： 复核人： 质检中心主任签名： 日 期： 年 月 日 控制菌检查方法验证原始记录 文件编号：SOP.PC-JT-23-01-03品 名规 格批 号数 量来 源检验日期年 月 日检 验 依 据中国药典2010年版一部报告日期年 月 日 紫外消毒时间时 分 时 分记录编号试验用培养基：培养基名称批号培养基名称批号胆盐乳糖培养基营养肉汤培养基MUG培养基麦康凯琼脂培养基胆盐乳糖发酵培养基一 供试品控制菌检查检查项目：需做的检查在内划“”大肠埃希菌项目BLMUGIEMB革兰染色LacIMViC结果标准规定检品g不得检出g阳性对照阴性对照大肠菌群0. 1g0.01g0.001g阴性对照EMB乳糖

20、发酵管结果标准规定个g小于100个g沙门菌 项目对照肉汤TTBEMB DHLTSIH2SI ULDKVN，动力AF“O”血清结果标准规定凝集对照检品g不得检出g阳性对照阴性对照二 试验组及阴性菌对照组控制菌检查检查项目：需做的检查在内划“”大肠埃希菌 检查方法的验证操作方法：取胆盐乳糖培养基100ml，加入 10ml的供试液及10100cfu试验菌，取胆盐乳糖培养基中的培养物0.2ml，接种到含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。阴性菌对照组同法操作。检品培养基名称供试品 + 试验菌（大肠埃希菌）阴性菌对照组（金黄

21、色葡萄球菌）本底对照胆盐乳糖培养基MUG培养基靛基质结 果大肠菌群检查方法的验证操作方法：取不少于10ml胆盐乳糖发酵培养基管3支，加入1：10供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）及10100cfu试验菌。取上述产酸产气的发酵管中的培养物，分别划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，培养1824小时 ，同时用胆盐乳糖发酵培养基管作本底对照，阴性菌对照组同法操作。检品培养基名称供试品 + 试验菌（大肠埃希菌）阴性菌对照组（金黄色葡萄球菌）胆盐乳糖发酵培养基麦康凯琼脂培养基本底对照结 果沙门菌检查方法的验证操作方法：取营养肉汤培养基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供试品使均匀，另

22、1份加入稀释剂10ml作阴性对照，1824h35观察。轻微摇动供试品增菌培养瓶，吸取1ml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养1824h。轻微摇动供试品增菌培养瓶，划线于麦康凯琼脂(MacC)培养基平板，培养2448小时 ，同时用胆盐乳糖发酵培养基管作本底对照，阴性菌对照组同法操作。检品培养基名称供试品 + 试验菌（大肠埃希菌）阴性菌对照组（金黄色葡萄球菌）四硫磺酸钠亮绿培养基麦康凯琼脂培养基本底对照结 果三 验证结果大肠埃希菌方法验证结果项目加菌量BLMUGIEMB革兰染色LacIMViC结 果供试品试验组阴性对照菌组阴性对照大肠菌群方法验证结果项目加菌量胆盐乳糖发酵培养基

23、管EMB革兰染色乳糖发酵管结 果123供试品试验组阴性对照菌组阴性对照沙门菌方法验证结果 项目加菌量肉汤TTBEMB DHLTSIH2SI ULDKVN，动力AF“O”血清结果凝集对照供试品试验组阴性菌对照组阴性对照四 结果判定：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组应检出相应的试验菌。根据试验结果判定该品种控制菌可采用 法检验。 _检验人： 复核人： 质检中心主任签名： 日 期： 年 月 日 微生物控制菌检查方法 片验证方案 编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草 起草人： 起草时期： 年 月 日2.验证小组成员： 3.验证方案审核部门审核人日 期生产部生产车间QCQA4.验证方案

24、批准 批准人： 批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的本实验是关于 片的微生物控制菌检查试验的验证。验证结果应显示对 片的微生物控制菌试验方法，对检品中可能存在的微生物没有抑制作用，符合验证要求。1.2原理按照已建立的药品微生物控制菌检查方法，通过已知菌数试液的对照菌的培训对照，验证其操作方法适合该药品的微生物控制菌的检测的正确性。2.验证方法步骤2.1验证前的准备：将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应选择相应的阴性对照菌。2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品按照微生物控制菌检测方法进行平行试验，通过观测是否长菌来

25、判断。2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“ 片”的微生物控制菌检查试验对检品中微生物的抑菌性。试验结果应显示；阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组应检出试验菌。3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于5pa。3.1.3试验样品： 片 批号： 批号： 批号： 3.1.4培养基：培养基名称培养基批号配制日期有效期至营养肉汤

26、培养基BL增菌培养基MUG培养基 3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115高压蒸汽灭菌30min。3.1.6验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源： 菌株名称内控编号大肠埃希菌CMCC(B) 44102Ec-金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-编号由菌名首字母传代代数制备日期组成。3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌培养皿（直径90mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1试验菌种的制备和稀释接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至相应的营养肉汤或BL增菌液10ml中,3035培养1824小时。用无菌0.9%氯化钠

27、溶液将上述培养物进行倍比递增稀释，制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。4.2实验方法A试验组取1：10供试液10ml及含大肠埃希菌数为50100cfu的菌悬液1ml加入到100mlBL增菌液中，3035培养1824小时。 B阴性对照组采用金黄色葡萄球菌作为阴性对照用菌。方法同试验组。5.试验结果5.1验证用微生物的稀释度和接种量菌种名称稀释度接种浓度（cfu/ml）接种量（ml）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌5.2试验组和阴性对照组结果大肠埃希菌批号BL增菌液MUG靛基质试 验 组阴性对照组注：为1824小时有菌生长。6.结论： 阴性对照菌试验：检出阴性对照菌，大肠埃希菌18小时生长 。

28、该检验方法用于该样品的控制菌检验。检验人： 复核人：7.验证结果评价分析质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书。对验证结果的评审应包括：验证试验是否有遗漏；验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准；验证记录是否完整；验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需进一步补充试验。8.最终审批验证报告由验证组长审核后，报验证总负责人批准，并签发验证证书。验证报告 年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的微生物控制菌检查方法验证文件

29、对微生物限度检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：验证方案在实施过程中未做修改。验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内。验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实。验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。 片组分或检验条件改变时须重新验证。以上情况，请验证委员会审批！验证小组：年 月 日试验报告审批表验证名称微生物控制菌检查方法验证编号验证内容审阅会签质量部审核人： 年 月 日验证委员会意见：批准人： 年 月 日验证证书 验证证书编号： 验 证 名 称： 有 效 期： 上述方法已按验证方案进行验证，各项验证结果符合标准要求，批准按此方

30、法进行本品的控制菌检查。特发此证。 验证总负责人： 年 月 日 备注：微生物限度检查方法验证方案 编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草 起草人： 起草时期： 年 月 日2.验证小组成员： 3.验证方案审核部门审核人日 期生产部生产车间QCQA4.验证方案批准 批准人： 批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。2.验证方法

31、步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“ ”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化

32、培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。3.1.3试验样品： 批号： 批号： 批号： 3.1.4培养基：培养基名称培养基批号配制日期有效期至改良马丁琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基胆盐乳糖增菌培养基 营养琼脂培养基3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115高压蒸汽灭菌30min。3.1.6验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源： 菌株名称内控编号大肠埃希菌CMCC(B

33、) 44102Ec-金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501Bs-白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca-黑曲霉CMCC(F) 98003An-编号由菌名首字母传代代数制备日期组成。3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035下培养1824小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在2328下培养2448小时。将黑曲霉接种至改良马丁液体培养基中，在2328下培养57天。将上述培养物用0.9%

34、的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。4.2实验方法供试液的制备：取样品10g（ml）加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇使分散均匀，或用匀浆仪混匀，制成1：10均匀的供试液。A样品试验组取1：10供试品（相当于1g或1ml供试品）1ml，及各50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注肉汤琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基。B菌液组取上述制备菌液各1ml注入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加入肉汤琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉加入玫瑰红钠琼脂培养基。C供试品对

35、照组取上述1：10供试液1ml注入平皿中，分别倾注肉汤琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基。D稀释剂对照组取PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液各1ml及各50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注肉汤琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基。4.3培养 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在3035下培养48小时，将白色念珠菌、黑曲霉在2328下培养72小时，点计菌落数。5.试验结果5.1产品试验组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲

36、霉5.2供试品对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.3稀释剂对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称稀释剂对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.4菌液组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉6.回收率计算6.1稀释剂对照组菌回收率菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率稀释剂对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均

37、值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%。6.2试验组菌回收率菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数）÷菌液组的平均菌落数×100%。7.结论：7.1经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为 %、 %、 %、 %、 %。7.2稀释剂回收率为 %、 %、 %、 %、 %。 以上验证结果证明，本品 采用上述方法

38、进行微生物限度检查。检验人： 复核人：8.验证结果评价分析质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书。对验证结果的评审应包括：验证试验是否有遗漏；验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准；验证记录是否完整；验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需进一步补充试验。9.最终审批验证报告由验证组长审核后，报验证总负责人批准，并签发验证证书。验证报告 年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的微生物限度检查方法验证文件对微生物限度检查

39、法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：验证方案在实施过程中未做修改。验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内。验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实。验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。 片组分或检验条件改变时须重新验证。以上情况，请验证委员会审批！验证小组：年 月 日试验报告审批表验证名称微生物限度检查方法验证编号SOP-V-028验证内容审阅会签质量部审核人： 年 月 日验证委员会意见：批准人： 年 月 日验证证书 验证证书编号： 验 证 名 称： 有 效 期： 上述方法已按验证方案进行验证，各项验证结果符合标准要求，批准按此方

40、法进行本品的控制菌检查。特发此证。 验证总负责人： 年 月 日 备注：微生物检验方法验证方案一 概 述：通过验证以确认所采用的微生物限度检测方法适合于湖南金旺稀贵药业有限公司所生产原料药的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于所生产原料药的控制菌的检查。根据样品特性制定检验方法和检验条件按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。二 目 的：通过验证确认所采用的方法适合于所生产原料药的微生物限度的测定。三 适用范围：本方案适用于本公司生产的四种原料药的微生物限度检验方法的验证。四 责 任 人：验证小组成员及相关人员。五 验证方案内容：1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽

41、孢杆菌、黑曲菌、白色念珠菌为验证用菌株。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，这三种菌株为细菌计数验证用菌株；黑曲菌为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株。验证用菌株的传代次数不得才超过5代。细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证1.1当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适用于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌级数同时进行。1.2 验证菌菌液制备1.2.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆

42、菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，3537培养1824小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-610-7，制成每1ml含菌数50100cfu的孢子悬浮液。1.2.2 白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，2328培养2428小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释至10-610-7，制成每1ml含菌数50100cfu的孢子悬浮液。1.2.3 黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，2328培养57天，加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌