2植物组织DNA的提取和鉴定

1、拟南芥t-dna插入突变体的鉴定实验目的1. 通过实验学习并掌握用ctab來提取dna的方法。2. 了解ctab的成分及作用。3. 学习pcr的原理并掌握其方法。4. 学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。实验原理植物组织屮绝大部分是核dma,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋 £1 (即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。ctab(十六烷基三甲基溟化钱, 简称ctab):是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在 高盐溶液中(0. 7mol/l n&c1)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度 (0. 3mol /l nacl)时从溶液中沉淀,通过离心就口j

2、将ctab与核酸的复合物同蛋白、 多糖类物质分开，然后将ctab与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液屮，再加入 乙醇使核酸沉淀,ctab能溶解于乙醇中。dna是遗传信息的载体和基本遗传物质, 它在遗传变异、代谢调控等方而起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的 对象，但无论是研究植物dna的结构和功能，还是开展外源dna的转化、转导的 研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化dnaot-dna,转移dna (transferred dna ),是根瘤农杆菌ti质粒中的一段dna 序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经 过改造的t-dna区，借助

3、农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 获得转基因植株。除用于转基因以外，t-dna插入到植物的基因中可引起基因的 失活，从而产生基因敲除突变体；t-dna大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传 分析。pcr基本原理：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),简称pcr,是一种分子生 物学技术，用于在体外快速扩增dna,具有类似细胞内dna的复制过程：由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复 性（退火）成为引物-dw单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引 物沿单-链模板延伸成为双链dna （引物的延伸）；

4、这种热变性-复性-延伸的过程, 就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna 片段。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定dna片断的典型方法，其特点为简便、 快速。dna片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基木相同，dna分子 在高于其等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。dna分子在电场屮通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还冇分子筛效 应，与分了大小及构想有关。对于线形dna分了，其电场中的迁移率与其分了量 的对数值成反比。在凝胶中加入少量澳化乙锭（冇毒！），其分子可插入dna的碱 基之间，形成一种光络合物，在254365nm

5、波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧 光，因此可对分离的dma进行检测。电泳时以混酚蓝及二卬苯氤（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：增大 样品密度，确保dna均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，了解样品泳动情况, 使操作更为便利；以0. 5xtbe做电泳液时澳酚蓝的泳动率约与长700bp的双 链dna相同，二甲苯氧（蓝）则与2kbp的dna相同。t-dna插入突变体pcr鉴定图解：bposbposdnadnabpbpgenomet-dna插入突变体的引物位点pcr电泳图验仪器材料和试剂实验材料：拟南芥叶片实验仪器：电热恒温水浴锅；离心机；液氮罐；研钵；离心管；移液管；稳压稳流电泳仪； 可调微量移液器

6、；水平电泳槽；暗箱紫外透射仪。实验试剂：ctab分离缓冲液；氯仿/异戊醇；无水乙醇；70%乙醇溶液；naac； te缓冲液； 电泳缓冲液；加样缓冲液；溟化乙锭（eb）溶液；琼脂糖凝胶（浓度为1.2%） o 实验步骤（1）.植物dna的提取1. 取ctab分离缓冲液加入离心试管中，于65°c水浴预热；2. 取2-3片新鲜叶片于离心管，加入液氮研濟细粉末；3加入600 ul预热的ctab分离液，轻轻转动，混匀，65°c水浴保温45min；4. 12000rpm 离心 10min；5. 将上清液转移到新离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻摇动，混匀；6. 12000rpm离心5

7、-10min,将上清液转移到新离心管；7. 向上清屮加入1/10体积3m naac,再加入两倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混 匀,冰上放置lomin；8. 12000rpm离心lomin,弃上清,加入500 ul70%乙醇溶液洗涤2min；9. 12000rpm离心5min,弃上清吸干残留并干燥；10. 加40 u1te缓冲液溶解dnao.pcr反应按照下表装填反应体系：反应物用量（ul）h.012.310x buffer2.0dntps0.5mgcl22.0lp/bp0.5rp0.5taq聚合酶0.2dna2.0总计20.0调节 pcr 仪，使其按照 94°c 5min, 94

8、6;c 30s, 53°c 30s, 72°c lmin30s, 重复33次，72°c lomin的方式进行。.琼脂糖凝胶电泳1 凝胶板的制备：取琼脂糖0. 48g,加0.5xtbe缓冲溶液40ml,微波熔化,制成12%的琼脂 糖胶液。将60°c凝胶不间断倒入胶床，高3-4mm,避免气泡，室温下凝固。完 全凝固后，置于电泳槽屮，加入电泳缓冲液，高于胶面1 2mm,从-头轻轻斜 拉出梳子，除去产生的气泡。2. 加样：在两份pcr产物中各加4 ul6 x loading buffer,在样品dna中加缓冲液2 ul, 混匀，用微量进样器加样，加样量10山（加

9、样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶 面以及穿透凝胶底部）。3. 电泳：120v电压电泳,至少40mino4. 染色、观察、显微照相与记录：关闭电源，取出胶床，浸入eb溶液中，lomin后取出。在紫外检测仪下观 察凝胶屮的dna,并进行显微照相。实验结果及分析1.实验结果：注释:第一孔道为dl2000 marker；第五至七孔道为本人实验结果（25号样品）， 依次是pcr而的样品dna、弓|物为lp&rp的pcr产物和引物为ep&rp的 pcr产物。2.实验分析：若拟南芥为野生型，即无t-dna插入，不存在bp位点，因此，电泳吋，只 有lp&rp的pcr产物存在，而bp&rp的pcr产物不存在；若拟南芥为纯合突变体,即两条链均有t-dna插入，都存在bp位点，因此电泳时，由丁大片段的插入，lp&rp的pcr产物不存在，只冇bp&rp的pcr 产物存在；若拟南芥为杂合突变体,即有一条条链有t-dna插入，其中存在bp位点,因此电泳时，突变的那条链,由于人片段的插入，lp&rp的pcr产物不存在