丛枝菌根真菌对砷胁迫下水稻砷酸盐还原酶基因表达的影响

1、    丛枝菌根真菌对砷胁迫下水稻砷酸盐还原酶基因表达的影响    蒋可欣林会赵斌摘要：试验以水稻（oryza sativa l.）金优64为宿主，以4种丛枝菌根真菌glomus mosseae、glomus intraradices、gigaspora margarita、gigaspora rosea为接种剂，通过盆栽试验研究在砷胁迫下4种丛枝菌根真菌分别与水稻金优64共生后对水稻的促生效应。结果表明，丛枝菌根真菌与宿主之间具有选择偏好性，水稻接种glomus mosseae与接种其他3种丛枝菌根真菌相比，长势较明显，地上部砷的积累也较低。砷胁迫下接

2、种不同种属的丛枝菌根真菌对水稻体内砷酸盐还原酶基因的表达影响也不同，推测砷胁迫下接种不同的丛枝菌根真菌对水稻砷代谢途径的调控机制是不同的。关键词：水稻（oryza sativa l.）；丛枝菌根真菌；共生；砷酸盐还原酶基因；砷代谢途径；长势：q945.78 ：a ：0439-8114（2014）16-3770-06abstract： taking jinyou 64 rice as the host plant， four kinds of arbuscular mycorrhizal fungi glomus mosseae， glomus intraradices， gigaspora，

3、margarita， gigaspora rosea were used for the inoculum. the result of pot experiment showed that the effect of arbuscular mycorrhizal fungi symbiosis with host on rice growth was different under arsenic stress. there was a selection between arbuscular mycorrhizal fungi and the host. when rice was ino

4、culated with glomus mosseae， the rice growth was better and the arsenic accumulation in shoot of rice was lower compared with the other arbuscular mycorrhizal fungi symbiosis with rice. the effect of rice inoculated with arbuscular mycorrhizal fungi on the expression of arsenate reductase gene was d

5、ifferent under arsenic stress.key words： rice（oryza sativa l.）； arbuscular mycorrhizal fungi； symbiosis； arsenate reductase gene； arsenic metabolic pathways； growth水稻（oryza sativa l.）是中国重要的粮食作物，砷污染的地下水灌溉和土壤砷污染都会造成砷在水稻中的富集，危害人类健康。例如湖南郴州，用砷污染的地下水浇溉水稻，造成水稻子粒中砷含量高达7.5 mg/kg1。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza

6、l fungi，amf）是自然界中分布极为广泛的一类土壤真菌，能与陆地上90%的植物形成菌根共生体。玉米（zea mays l.）和紫花苜蓿（medicago sativa l.）接种amf后可抑制砷向地上部的转移，降低砷对植物地上部分的毒害作用2。在砷胁迫下，水稻品种lapar-9接种丛枝菌根真菌glomus mosseae与不接种的相比，降低了地上部中砷的含量，有效地抑制了砷向地上部的转移3。关于砷在植物体内的吸收及代谢途径，目前仍有很多地方尚不清楚。从目前的研究来看，砷酸盐因其与磷酸盐化学性质非常相似，所以主要通过磷酸盐转运蛋白进入植物体内，亚砷酸盐则通过水通道蛋白进入植物体内，五价砷进

7、入植物体内很快会被砷酸盐还原酶还原为三价砷，三价砷与植物络合素、谷胱甘肽等形成络合物存储于液泡中，以限制砷在植物体内的移动性，降低砷的毒性4。目前研究较为透彻的水稻砷代谢相关基因是亚砷酸盐转运蛋白（lsi1、lsi2）表达基因，其突变株会显著降低亚砷酸盐在水稻中的富集5，并且接种丛枝菌根真菌glomus intraradices后其表达量也显著下降6。duan等7研究发现，水稻中砷酸盐还原酶基因osacr2有2个亚型，分别为osacr2.1（genbank收录号：ay860059）、osacr2.2（genbank收录号：ay860058）。amf可改善大部分植物对砷的耐受性，但amf与水稻共

8、生后能否改善水稻对砷的耐受性目前鲜有报道。本试验主要研究了在砷胁迫下， 水稻与不同种属的amf共生后对水稻生长和耐砷性的影响， 以期了解amf对水稻砷代谢相关基因的影响，从而可以更好地改善砷胁迫下水稻的种植方式， 降低水稻子粒中砷的浓度， 这对人类健康具有重要意义。1 材料与方法1.1 试验材料供试水稻品种为金优64。供试amf有glomus mosseae、glomus intraradices、gigaspora margarita、gigaspora rosea，每种amf作为接种剂，其中含有被感染的植物根段、am真菌菌丝、孢子和盆栽土壤混合物。1.2 试验设计1.2.1 砷胁迫试验设计

9、 砷胁迫采用盆栽试验，共设8个处理，其砷浓度分别为0（ck）、4、8、12、16、20、24、28 mmol/l，所用试剂为na3aso4·12h2o，每个处理3次重复。每盆栽种经过表面消毒及催芽5 d的水稻苗6棵。水稻苗种下后7 d内浇水，保持每个盆钵中土壤湿润且没有水分溢出，7 d后每2 d浇1次砷处理溶液，每次10 ml，一共浇5次，最终土壤中所加的砷浓度分别为0、60、120、180、240、300、360、420 mg/kg。21 d后收样，检测植物鲜重，半定量pcr检测osacr2.1、osacr2.2表达量情况。 1.2.2 菌根侵染对osacr2.1、osacr2.2

10、表达量的影响试验 菌根侵染对osacr2.1、osacr2.2表达量的影响试验采用盆栽试验，共设5种接种处理，分别为不接种amf的空白对照及接种g· mosseae、g· intraradices、g· margarita、g· rosea处理，接种量为10%（w/w）。水稻播种后7、14、21、28、35 d取样，采用打孔法取得新鲜的根样，用蒸馏水将根洗净，剪成约1 cm长，采用trypan blue（tb）染色法进行染色，随机挑取40条1 cm长的根段，检测菌根侵染率。水稻播种后7、21、35 d收取植物样品，分别提取根部和地上部的rna，反转录后，

11、半定量pcr检测osacr2.1、osacr2.2表达量情况。1.2.3 砷胁迫下接种amf对水稻生长的影响试验 选取上述5种接种amf处理，每一接种处理对应3种砷处理水平（0、240、420 mg/kg）。于水稻播种后35 d分别取样，分地上部与地下部称取植物鲜重后将样品置于70 烘箱中烘烤48 h，称量植物干重；取植物新鲜根样检测侵染率；抽取植物根部rna检测osacr2.1、osacr2.2表达量变化情况。检测植物根部、地上部中三价砷和五价砷的含量。将植物样品（根部、地上部）磨碎称重后，置于石英硝化管中，加入2 ml 2 mol/l三氟乙酸（trifluoroacetic acid，tf

12、a），将硝化管放入加热器中100 6 h，之后在120 将样品混合液烘干，烘干后剩下的沉淀物用蒸馏水重新溶解，并通过0.45 m的滤膜过滤，调ph至中性后用超纯水定容至10 ml6。定容后的提取液通过hplc-afs法检测三价砷、五价砷含量。1.3 数据分析所有数据采用microsoft excel 2003进行标准差分析，利用spss 19.0软件进行差异显著性分析。2 结果与分析2.1 不同砷浓度对水稻鲜重及基因osacr2.1、osacr2.2表达量的影响砷胁迫对水稻生物量的影响如图1所示。从图1可以看出，随着土壤砷浓度的升高，水稻的单株鲜重降低，长势越来越差。rt-pcr检测结果（图2

13、）表明，随着土壤砷浓度的升高，水稻根部osacr2.1、osacr2.2的表达量随之上升，且osacr2.1的表达量较osacr2.2高；在地上部，随着砷浓度的升高，osacr2.1的表达量有所上升，但不如根部明显，而osacr2.2的表达量则很低，在砷胁迫下并没有太明显的表达差异。2.2 菌根侵染率对基因osacr2.1、osacr2.2表达量的影响图3为接种不同amf后对水稻侵染率的检测结果，从图3可以看出，随着接种时间的延长，菌根侵染率也随之升高，水稻接种不同的amf其菌根侵染率也不一样，其中接种g. mosseae的菌根侵染率最高，在接种35 d时已达到86.99%。水稻接种不同amf

14、后，rt-pcr检测osacr2.1、osacr2.2的表达量情况如图4所示。由图4可知，在不接种amf的情况下，随着水稻的生长，地上部和根部的osacr2.1和osacr2.2的表达量之间均无明显差异，且osacr2.1的表达量较osacr2.2高，尤其在地上部，osacr2.1的表达量明显比osacr2.2高。水稻根部随着菌根侵染时间的延长，接种g· intraradices和g· rosea的osacr2.1的表达量随之上升，而接种g· mosseae、g· margarita的表达量与对照相比无明显差异；而在水稻根中接种amf的osacr2.2的

15、表达量与对照基本一致，无明显差异。在地上部，菌根侵染率的增加并不影响osacr2.1和osacr2.2的表达，说明接种amf并不影响osacr2.1和osacr2.2在地上部中的表达，因此后续试验重点研究水稻根中osacr2.1和osacr2.2在砷胁迫下的基因表达差异情况。2.3 砷胁迫下接种不同amf对水稻生长及基因osacr2.1、osacr2.2表达量的影响2.3.1 对菌根侵染率的影响 对砷胁迫下接种不同amf的水稻的菌根侵染率进行检测，结果如图5所示。由图5可知，随着土壤中砷浓度的升高，接种g· intraradices、g· margarita、g·

16、 rosea的菌根侵染率都显著下降，而接种g· mosseae的菌根侵染率则无显著变化，说明土壤中砷浓度的升高并不影响g· mosseae对水稻根的侵染，而对其他3种amf则有一定程度的影响。2.3.2 对水稻生物量的影响 由表1可知，在不加砷时，接种g· mosseae的地下鲜重比ck1高38.30%，显著增加，接种g· intraradices和g· margarita与ck1差异不显著，而接种g· rosea的生物量则比ck1显著降低，地下干重的趋势与地下鲜重的趋势基本一致。从地上部来看， 接种g. mosseae、g·

17、; intraradices、g· margarita的地上鲜重与ck1差异不显著，比接种g· rosea的地上鲜重显著增加。高砷（420 mg/kg）胁迫下，接种g· mosseae的地下鲜重比ck3高29.22%，显著增加，接种g·intraradices、 g· margarita的地下鲜重与对照无显著差异，而接种g· rosea的地下鲜重则比对照显著降低。由以上结果可知，接种不同种属的amf对水稻生长发育的影响具有多样性。各砷浓度胁迫下，接种g·mosseae与不接种的对照相比促进了根部的生长，地上部与不接种相比长势

18、略好；而接种其他3种amf对水稻无促生效应。2.3.3 对基因osacr2.1、osacr2.2表达量的影响 在砷胁迫下，接种不同amf后对水稻根中的osacr2.2的表达量无明显影响，且根中osacr2.2的表达量比osacr2.1低（图6）。接种amf后osacr2.1的表达量与对照相比有较明显的差异，为了进一步确定其差异程度，对水稻根中osacr2.1表达进行qpcr检测，结果如图7所示。由图7可知，在正常生长条件下，即不添加砷时，接种amf对osacr2.1表达无明显影响，而在高砷（420 mg/kg）胁迫下，接种g· mosseae后osacr2.1的rna相对转录量比对照

19、低，接种g· intraradices的osacr2.1的rna相对转录量比对照要略微高一些，接种 g· margarita、g· rosea的osacr2.1的rna相对转录量与对照相比差异较明显，推测接种不同的amf对水稻砷代谢途径的影响机制不同。 2.3.4 对水稻体内砷含量的影响 大部分研究结果认为， 在砷污染土壤里种植的水稻中砷含量的分布趋势为根>茎秆>谷壳>谷粒8。本试验根中砷含量的检测结果表明，其总的无机砷的含量均很低， 即使是在高砷条件下无机砷的总含量也不超过4 mg/kg，这可能是因为砷提取方法的不同造成的。试验为了检测水稻组织

20、中不同价态的砷含量，采用三氟乙酸提取法， 与常用的强酸消化法有所不同， 提取条件较为温和， 这使得根中砷的提取效率偏低， 从而所检测出的砷含量与实际的砷含量偏差较大， 不利于结果分析， 因此接下来主要分析地上部砷含量的变化情况。由表2可知，在不加砷的条件下，各处理地上部的砷含量都很低， 其总的无机砷的含量均不超过4 mg/kg。高砷（420 mg/kg）胁迫下， 接种g· mosseae处理的水稻与对照相比其总砷含量较低，而接种g· intraradices、g· margarita、g· rosea处理的水稻与对照相比其总砷含量偏高。从表2还可以看出，

21、在地上部砷的价态主要为五价，造成这一现象的原因可能是：五价砷进入根中后被砷酸盐还原酶还原为三价砷，三价砷进一步与植物络合素、谷胱甘肽等结合形成络合物被固定在植物液泡中，限制了三价砷向地上部的转运，因此在砷过量的情况下，被转运到水稻地上部的大部分是未被还原为三价砷的五价砷；在砷的提取过程中，因提取条件等外部环境的变化，如ph、氧化还原电位等的改变，使得三价砷在提取过程中部分被氧化为五价砷8。3 讨论在砷胁迫下水稻接种不同的amf对水稻的生长发育具有不同的影响， 从试验结果可知， 接种g. mosseae对水稻的生长具有促生效应，尤其表现在提高根系的生长，而接种其他3种amf对水稻的生长没有明显的

22、促生效应，说明amf与宿主之间具有选择性。christophersen等9研究发现，在砷胁迫下接种g· mosseae比接种g· intraradice更有利于苜蓿的生长。水稻品种guangyinzhan分别接种g·intraradices、g· geosporum，发现在砷胁迫下接种g· intraradices会促进水稻根部的生长，接种g· geosporum则对水稻根的生长没有明显影响，而另一水稻品种handao 502在砷胁迫下接种g· geosporum能促进水稻根的生长，接种g· intraradice

23、s则对水稻根的生长无明显影响10。可见不同水稻品种因其基因型不同与不同的amf共生后所产生的促生效果也不一样。在高砷胁迫下，水稻接种不同的amf后植株体内砷的积累量也有所不同，对于这一现象产生的原因则可能是因为不同种属的amf与水稻共生后对水稻耐砷机制的调控有所不同。在砷胁迫下接种amf对osacr2.2的表达无明显影响，在不接种amf的情况下，土壤中砷浓度的提高对其表达量的影响也没有osacr2.1的明显，且osacr2.1、osacr2.2在大肠杆菌中超表达提取纯化的蛋白，体外检测其砷酸盐还原酶活性，发现osacr2.1的砷酸盐还原酶活性比osacr2.2的要高，说明在水稻体内osacr2

24、.2并不是最主要的砷酸盐还原酶功能基因7。砷胁迫下接种不同的amf对osacr2.1的表达影响也不同。推测产生这种结果的原因：amf本身具有一套独特的砷代谢机制，在土壤中砷浓度过高时，砷酸盐与磷酸盐竞争通过磷酸盐转运蛋白进入到根外菌丝中，而amf本身可将部分砷从菌丝内排出，进而降低了水稻根中五价砷的浓度，所以osacr2.1的表达量也随之下降。如具有砷酸盐抗性的兰属菌根真菌hymenoscyphus ericae与对照相比可将体内近90%的砷排出体外，且砷均以三价砷的形式排出11。最近研究发现， 在g· intraradices中克隆到的基因giarsa与亚砷酸盐的排出有关12。os

25、acr2.1表达量的下调可能会导致砷向地上部的转移。对拟南芥（arabidopsis thaliana）砷酸盐还原酶基因atacr进行敲除，发现敲除atacr后其地上部分积累的砷是野生型的1016倍， 而根中砷的含量比野生型的低13。因此推测接种g. mosseae后水稻根中osacr2.1表达量下调，促进了砷向地上部分的转移，从而减轻了砷对根的毒害，促进了根的生长。因砷酸盐是通过磷酸盐转运蛋白进入根中，所以amf也可能通过调控磷酸盐转运蛋白的表达来改变植株对砷的吸收。如大麦（hordeum vulgare）接种g· intraradices后下调了磷转运蛋白基因hvpht1；1、h

26、vpht1；2的表达，而上调了基因hv-pht1；8的表达，且与对照相比接种g· intraradices的大麦体内砷浓度较低，降低了对砷的吸收14。目前水稻中共克隆到13个属于ospht1家族的磷酸盐转运蛋白，但是目前并没有完整的关于砷胁迫下接种amf后对整个磷酸盐转运体系影响的研究报告。砷胁迫下接种不同amf对水稻砷酸盐还原酶基因表达的影响不同，可能是由于以上原因的综合作用，也可能是因为本试验研究的只是砷代谢途径中的一种酶，而并不清楚接种amf对整个砷代谢途径的影响，五价砷还原为三价砷只是砷代谢途径的第一步，之后还包括三价砷的转运和络合等。砷酸盐还原酶并不涉及砷酸盐的吸收，且还原

27、后三价砷的转运主要与亚砷酸盐转运蛋白相关，接种不同的amf可能对亚砷酸盐转运蛋白产生不同的影响。如水稻nipponbare接种g· intraradices后下调了亚砷酸盐转运蛋白lsi1、lsi2的表达，降低了水稻对亚砷酸盐的吸收6。绒毛草（holcus lanatus）对砷的耐受性还与植物络合素的积累有关，与非砷耐受性的绒毛草相比对砷超耐受的绒毛草体内植物络合素的表达显著上升，促进了砷在液泡内的隔离，缓解了砷的毒害作用15。本试验研究的砷酸盐还原酶基因是砷代谢途径的一个重要的还原酶，了解到在砷胁迫下接种不同的amf对砷酸盐还原酶基因表达的影响也是不同的，但是这并不能断定接种哪一种

28、amf会对水稻的生长、耐砷性更好，因为砷酸盐的还原只是砷代谢途径中的一步，目前接种amf对水稻整个砷代谢途径的影响机制仍不是十分清楚，还有待进一步研究。 参考文献1 陈保卫， chris l x. 中国关于砷的研究进展j. 环境化学，2011，30（11）：1936-1943.2 xu p l， guo y k， bai j g， et al. effects of long-term chilling on ultrastructure and antioxidant activity in leaves of two cucumber cultivars under low lightj.

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