浙江中医药科学技术奖申报书-康恩贝

1、浙江省中医药科学技术奖申报书成果名称浙江中药饮片炮制规范关键技术研究与应用主要完成人赵维良、宋剑锋、王如伟、戚雁飞、张文婷、郭增喜、胡江宁、赵四清、 马临科、冯敬骞、徐礼萍、黄琴伟、何厚洪主要完成单位 （蛊章）浙江省食品药品检验研究院主要协作单位 （蛊章）衢州市食品药品检验研究院、浙江康恩贝制药股份有限公司任务来源项目编号研究起止时间起始2011-01验收/鉴定日期>>«* a 20 - 2018-01-12完成2015-12成果登记号学科分类及代码类别代码推荐单位 意见单位负责人（签名）单位公章年月日中报联系人联系人电话19项目简介项目：研究背景、主要研究内容及结果、应

2、用推广及取得的社 会、经济效益等为提高浙江省炮制规范的水平，保证临床用药材饮片的质量，在 2015年版炮制规范的增订提高工 作中，本项目采用现代先进的光谱、色谱技术研究建立能切实控制饮片质量的质控方法，用现代的药 理学方法验证药材饮片的药效作用，建立了独立于中国药典甚至高于药典的方法，尤其是建立了能显 示浙江道地药材特点和质量的方法。主要研究内容如下：一、首次以药效学试验证实常山胡柚的未成熟果实衢枳壳具理气宽中功效，与中国药典的收载品种枳壳的3个不同来源酸橙、代代花、朱栾的理气宽中功效无显著差异。首次通过TLC鉴别、水分和总灰分的检查，柚皮甘、橙皮甘和新橙皮昔3种成分的含量测定，证实衢枳壳与枳

3、壳化学成分类似，质量符合中国药典枳壳项下的要求。首次研究制订了彳瞿枳壳的药材饮片标准，结果收载于2015年版浙江省中药炮制规范。二.首次研究灵芝抱子脂肪酸脂成分的指纹图谱技术用于有效鉴别意项仁油、鸦胆子油、山茶油、米 糠油、花生油等10种油类混淆品。首次研究用HPLC-ELSD法测定破壁灵芝抱子粉中三油酸酯甘油等 8个油脂类成分的含量。并把这些方法首次应用正式颁布的标准。三.对延胡索水溶性非生物碱类化合物用三甲基硅烷衍生化GC-MS方法进行研究，首次从延胡索中鉴定得到核糖酸-1, 4-内酯、3, 4-二羟基-2-默基-吠喃等16个化合物，首次对延胡索水溶性非生物碱 类化学成分分析检测方法进行研

4、究，对延胡索酰胺类化合物提取物及其制备方法进行研究，研究结果 获得授权专利二项。四.首次以草乌的剧毒成分二酯型生物碱和有效成分单酯型生物碱为指标，对浙江省草乌的传统炮制 工艺设计了正交试验研究，结果证实，浙江传统工艺水漂洗加豆腐煮的方法，可使剧毒成分二酯型生 物碱的含量下降，且下降程度与豆腐用量成正比，这一结论表明浙江省传统炮制方法比中国药典收载 不加豆腐水煮的方法科学，研究结果并为该炮制工艺提供了各因素的最佳水平。五.对土茯苓落新妇含量测定进行研究，根据日常检验及文献报道，土茯苓样品间落新妇昔含量差别巨大，达10倍以上，但一直未知原因。我们首次研究发现有一种根茎粗大，断面颜色发红的样品含量差

5、别巨大，进一步实地调查，该样品产于越南。而国内产样品间含量数据较为恒定。另首次研究发现中国药典方法落新妇昔含量测定数据不稳定，原因系落新妇昔对热敏感， 加热提取时易转化为异构体，改用超声仪提取的方法，即可防止此种转化，使测定数据变得稳定。六.对浙八味之一的浙麦冬的外观特征、显微鉴别、薄层色谱、指纹图谱、含量测定等测定内容进行了研究，形成了浙麦冬质量标准，并作为一个药材规格收载于浙江省中药炮制规范2015年版麦冬项下。制定的浙麦冬麦冬龙脑甘( C21H36O10)的含量限度为不得少于 0.010%,此限度既能保证浙麦 冬的质量，又能有效排除川麦冬。七.另对浙贝母、白术、川乌、附子、半夏、虎掌南星

6、、绵革薜、粉草薜、意四根、滴水珠、茶树根、 水杨梅根、落新妇、分心木、苦石莲、养麦、尊菜、四季菜、酢浆草、胡颓子叶、金莲花、人参花、 泽漆、铁树叶、白残花、天青地白草、猪殃殃、乌韭、三七花、溪黄草、木通七叶莲、仙人杖、伏龙 肝、铁落、铅丹、硝石、人中白等三十七个品种的质量标准进行提高，制定了完善的标准，更好地服 务于监管。本项目共有43个药材饮片标准经专家审核通过，收载于浙江省中药炮制规范2015年版，其中新增1个，由不常用提升为常用 30个，新增项目和提高限量要求的 5个。有7项检测新方法和技术为国 内外首次研究，其中有5项首次应用于颁布执行的标准， 首次从研究的药材中发现化合物16个化合物

7、。取得授权发明专利 2项，在国内外杂志发表论文 24篇。上述标准均应用于实际生产、使用和检验，并从颁布起一直有效实施。本项目的完成实施，提高了药 材饮片的质量，保证了临床配方用药安全有效，新增经济效益2亿元，促进药材种植业发展，提高农民收入，社会和经济效益显著。主要创新点（一）首次以药效学试验证实常山胡柚的未成熟果实衢枳壳具理气宽中功效，与中国药典的收载 品种枳壳的3个不同来源酸橙、代代花、朱栾的理气宽中功效无显著差异。首次通过TLC鉴别、水分和总灰分的检查、柚皮甘、橙皮甘和新橙皮昔3种成分的含量测定，证实衢枳壳与枳壳化学成分类似，质量符合中国药典枳壳项下的要求。首次研究制订了衢枳壳的药材饮片

8、标准，结果收载于2015年版浙江省中药炮制规范。项目研究成果对常山县常山胡柚种植业和农民创收贡献极大，获常山县人民政府的表扬。1.研究背景常山胡柚（Citrus changshan-huyou Y.B.Chang）主产于浙江衢州地区，常山、龙游、江山、开化等 地，以常山为重点产区，常山县青石乡胡家村为常山胡柚的起源地，资源丰富，产量高。常山胡柚成 熟果实营养丰富，为美味的食用水果，未成熟果实具有较高的药用价值。现代药理表明常山胡柚具有 镇咳化痰、清热解毒、促进胃肠功能；抗氧化、降血脂、降血压等功效。收集常山胡柚未成熟果实（以下简称常山胡柚），经过烘制晾晒，干后加工为常山胡柚片，即“衢枳壳”，已

9、有较长历史。每年仅从衢州的产量就超过三千吨，超过全国市场所有枳壳量的三分之一。但中国药典和原浙江省中药饮片炮制规范枳壳（以下简称药典收载品种）中均没有收载常山胡 柚这一来源。据文献报道，来源于常山胡柚的“衢枳壳”与药典收载的“枳壳”，性状和成分均相似，>>«* a 20 - 9不少医院亦将其用作枳壳。本课题组前期的相关工作也证实了这一点。浙江大学张上隆、徐昌杰等对 常山胡柚、酸橙等运用RAPD、ITS和AFLP等分子技术进行鉴定，发现常山胡柚的 ITS1A与柚完全一致，常山胡柚的ITS1B与酸橙完全一致，表明常山胡柚很可能是柚和酸橙的天然杂交种，这与药典 收载品种的来源（

10、酸橙的栽培变种）相似。这些都为本研究的开展奠定了良好的基础。2 .样品的采集与鉴定：本课题组已从常山县、柯城区、衢江区等十处共采集了 161份常山胡柚样品， 从性状等方面进行了初步的分析，经浙江省食品药品检验研究院郭增喜主任中药师、衢州食品药品检 验研究院宋剑锋副主任中药师和常山县胡柚研究院赵四清高级农艺师鉴定为常山胡柚不同生长期的果 实。3 .药效研究：衢枳壳的两个样品胡柚 1号、胡柚23C样品与药典枳壳的三个样品枳壳22B （酸橙）、枳壳25 （代代）、枳壳27 （朱栾）进行正常小鼠小肠碳末推进及胃排空试验、阿托品造模小鼠小肠碳 末推进试验、小鼠气管酚红排泌试验、豚鼠离体回肠收缩试验、豚鼠

11、离体气管平滑肌收缩试验及大鼠 离体子宫收缩试验。结果表明：1）胡柚和枳壳对小鼠体重均未见影响；2）与空白对照组比较，胡柚与枳壳均能显著提高正常小鼠的小肠碳末推进率（P <0.05）; 3）衢枳壳2个样品与枳壳3个样品比较对提高正常小鼠的碳末推进率无显著差异（P >0.05）; 4）与模型组比较，衢枳壳2个样品与枳壳3个样品对提高阿托品小鼠的碳末推进率均无显著差异（P >0.05）; 5）与对照组比较，2g生药/kg的两个衢枳壳样品和三个枳壳样品均能显著增加小鼠气管酚红排泌量（P <0.05），但衢枳壳和枳壳各个样品的各个剂量组之间均无显著差异；6）衢枳壳2个样品和枳壳3

12、个样品的0.5 mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml剂量均能显著抑制豚鼠离体回肠的自主收缩，衢枳壳2个样品和枳壳3个样品的高剂量（2.5mg/ml）和中剂量（1.25mg/ml）的离体回肠收缩效应值经LSD检验，均无显著差异（P >0.05）,胡柚23C样品低剂量（0.5mg/ml）的效应值显著低于胡柚1号样品和枳壳25样品（P <0.05）,其它样品的低剂量间无显著差异（P >0.05）; 7）衢枳壳2个样品和枳壳 3个样品的0.5mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml剂量 均能显著抑制豚鼠离体气管平滑肌的自主收缩，上述5个样品高剂量（2.5mg/ml

13、）、低剂量（0.5mg/ml）的离体回肠收缩效应均无显著差异（P >0.05）,枳壳25样品中剂量（1.25mg/ml）的效应值显著低于胡柚1号样品和枳壳22B样品（P <0.05）,其它样品的中剂量间无显著差异（ P >0.05）; 8）衢枳壳2个 样品和枳壳3个样品均能抑制子宫的自主收缩。上述研究结果表明：衢枳壳和药典枳壳药理作用基本 一致。4 .安全性研究：安全性研究研究结果表明，经小鼠 1天内灌胃给予可配制的能用于小鼠灌胃的最高 浓度和最大容积，14天内均未见小鼠死亡，也未见明显的中毒症状。得出胡柚片的最大给药量分别为 300g生药/kg,换算成60kg成人每天的用量

14、分别为1800g o研究结果表明：未见明显毒性。5 .多成分同时测定的研究：建立了同时测定常山胡柚中芸香柚皮甘，柚皮甘，橙皮甘，新橙皮昔， 橘皮内酯水合物，木犀草素，川陈皮素，桔皮素等8个成分的RP-HPLC方法。色谱柱为安捷伦 Agilent Extend C18色谱柱（5 dm, 4.6 x 250mm）;流动相为乙睛-0.1%甲酸溶液系统（梯度洗脱）；检测波长 为284 nm；体积流量1.0 mL/min ;柱温为40 C；峰面积外标法定量。并按该建立的方法，测得样品 中柚皮昔等8个成分的量。本方法简便、快速、准确、可靠，可为常山胡柚的质量控制提供参考，并 适合作为测定的方法。6 .指纹

15、图谱研究：以2010版药典中枳壳的液相条件为基础进行优化，最终确定芸香柚皮甘、柚皮甘、橙皮甘、新橙皮甘、橘皮内酯水合物、木犀草素、橘皮内酯、川陈皮素、桔皮素、葡萄内酯等十个成 分为特征性图谱的指标性成分。先将各品种进行种内比较，发现衢枳壳种内相似度均在95%以上，差异最小，说明衢枳壳化学成分的种类和含量稳定一致、质量可控。再将各枳壳品种进行种间相似度比 较，衢枳壳与中检院枳壳对照药材的相似度为95%97%,衢枳壳与酸橙枳壳的相似度为90%97%,而与甜橙的相似度仅为 6.5%16.6%。从化学成分的相似性角度说明衢枳壳与药典枳壳和酸橙的化学成 分非常相似，而与甜橙的化学成分差异较大。7 .成分

16、累积趋势研究：衢枳壳是以常山胡柚未成熟果切片晒干或烘制而成，但其内含主要柚皮昔、 新橙皮昔等药用成分在各个不同生长时间会产生很大变化，为了确定加工用胡柚未成熟果的最佳采收 时间，根据各项试验分析数据和民间采收经验，确定炮制胡柚片用常山胡柚未成熟果采收标准。对不 同发育阶段的常山胡柚未成熟果中三种活性物质含量进行测定，研究结果显示：5-10月份不同生长期果实中三种成分的含量变化较大，橙皮昔与新橙皮昔的含量变化表现一致，5月含量最高，后不断降低，而柚皮昔的含量则先上升后降低，6月所采样品中含量最高，后逐渐降低。同时 68月间采收的未成熟果，柚皮甘、橙皮甘和新橙皮昔的含量分别在12.65109.66

17、mg/g、0.4517.5mg/g和 8.06218.9mg/g ,参照国家药典枳壳的规定，柚皮昔的含量不得少于3.0%,新橙皮昔不少于 4.0%,因此加工用常山胡柚未成熟果的采收时间以68月为宜。建立了一种同时测定常山胡柚不同生长期果实中柚皮甘、橙皮昔、新橙皮昔含量的RP-HPLC方法，并研究常山胡柚不同生长期果实中三种成分含量的动态变化，从而确定常山胡柚作为药用资源的 最佳采收时间。按该建立的方法，测得常山胡柚不同生长期果实中柚皮甘、橙皮甘、新橙皮昔的含量 分别在12.65109.66mg/g、0.4517.50mg/g、8.06 218.90mg/g,含量上看，柚皮昔在六月时最高，橙 皮

18、甘和新橙皮昔在五月时最高，其中五七月间采收的果实，柚皮甘和新橙皮昔的含量均符合中国药典 枳壳项下含量的要求。8 .DNA基源研究：有报道应用ITS1序列检测结果显示，酸橙和柚极有可能是常山胡柚的杂交亲本， 首次证实酸橙为亲本，并通过序列比对，排除甜橙作为亲本的可能性。酸橙作为胡柚的亲本也为解释 胡柚的高耐冻能力提供了有力证据。通过比较常山胡柚（CSHY）样品与药典收载枳壳的3个样品（酸橙SC、代代花DDH、朱栾ZL）的DNA基源分析，得出常山胡柚和不同来源的枳壳在DNA基源分析方面的差异，常山胡柚、枳壳、代代聚为一类，呈现一定的DNA亲缘关系。【佐证材料】论文：1宋剑锋，冯敬骞*,徐礼萍，胡卫

19、南，程闯，祝春仙，方一超，柴鑫莉，赵四清，胡 建华，郑建李.枳壳与常山胡柚及其多个炮制品的质量评价J.中国药房，2015, 26 （30）:4258-4261. 2宋剑锋，冯敬骞*,胡建华，徐礼萍，傅厚道.常山胡柚不同生长期果实中 3种成分含量的动态变化J. 中国现代应用药学，2014, 31（12）:1474-1478.3宋剑锋，冯敬骞*,胡卫南，程闯，祝春仙，徐礼萍，柴鑫 莉，方一超.枳壳终端市场的质量现状调查J.中国药房，2015, 26（16）:2276-2278. 4徐礼萍，宋剑锋，赵四清，杨毅，岳超，冯敬骞*,戴德雄，毛培江，金捷，王也,徐勇慧，胡建华，黄晶晶，金祖汉*.常山 胡柚

20、与不同来源枳壳对理气宽中功能的药效差异比较J.中国实验方剂学杂志，2016, 22（7）:156-160.5郭增喜，李文庭，李兆奎.不同产地枳壳中柚皮昔和新橙皮昔的测定J.中草药，2012, 43（7）:1347-1348.标准：朱志泉，陈时飞，赵维良，王如伟，郭增喜，戚雁飞，宋剑锋，张文婷， 等.浙江省中药炮制规范2015年版P180衢枳壳。科技查新报告查新结论（1）。浙江省食品药品监督管理局标准起草证明函。常山县人民政府的表扬信。（二）首次研究灵芝抱子油脂肪酸脂成分的指纹图谱技术用于混淆品的鉴别，并首次测定破壁灵 芝抱子粉和油中三油酸酯甘油等8个油脂类成分的含量，并把这些方法首次应用正式颁

21、布的标准。9 .首次研究采用灵芝抱子粉指纹图谱技术对意项仁油、鸦胆子油、山茶油、米糠油、花生油、葵花籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油和橄榄油10种灵芝抱子油混淆品进行鉴别研究，结果灵芝抱子油能与10种混淆品明显区别，将该指纹图谱技术应用于浙江省中药炮制规范2015年版质量标准中。灵芝抱子油是从破壁灵芝抱子中用超临界方法提取的脂肪油，具有抗 肿瘤、提高免疫、保肝护肝、抗氧 化、抗衰老及治疗神经疾病等活性，一般认为灵芝抱子油的活性与其含有的不饱和脂肪酸有密切的关系，为灵芝抱子油重要有效成分。灵芝抱子粉提取脂肪酸酯油后 失去了抱子粉形态鉴定的依据，故市场见有其他植物油仿冒灵芝抱子油者。灵芝抱子油已有指纹

22、图谱 的研究，但仅指认1个成分，更未见其用于混淆品鉴别的研究。为更好控制质量，本实验特研究抱子 油指纹图谱，并指认了其中的8个主要特征成分峰，得到了区别其混淆品的专属性方法。本研究比较了不同的流动相系统，结果以乙睛-异丙醇（51 ： 49）等度洗脱时色谱指纹图谱峰形好，分离度理想。另比较了不同溶解溶剂，结果显示采用流动相乙睛-异丙醇（51 ： 49）溶液效果最好。还 试验了不同柱温 （25、30 和 35 C）、不同色谱柱（Agilent Zorbax SB-C18、Kromasil C18 和 ACCHROM Unitary-C18 ,规格均为（250 mm x 4.6 mm, 5 m）对指

23、纹图谱的影响，结果显示柱温及色谱柱对色谱 峰的分离和油脂类成分的含量影响较小。选择三油酸甘油酯作为灵芝抱子油指纹图谱的对照品，所得 色谱峰作为参照峰。此外，对精密度、重复性和稳定性等方法学进行了考察，结果均符合要求。对照指纹图谱的建立和色谱峰的指认按研究确定方法制备12批灵芝抱子油样品的供试品溶液并进样，测定由武义寿仙谷中药饮片有限公司提供的抱子油，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱 相似度评价系统 2.0版评价建立对照指纹图谱，并与对照品保留时间比较，指纹图谱中能指认亚甘油 三油酸酯、1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯、1,2-二亚油酸-3-棕桐酸甘油酯、1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯、 1

24、-棕桐酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1,2-二油酸-3-棕桐酸甘油酯、1,2二油酸-3-硬脂酸甘油酯8个峰。经对样品测定，记录色谱图，运用上述生成的灵芝抱子油对照指纹图谱作对照，采用 国家药典会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版，以甘油三油酸酯峰为参照峰，对12批样品进行指纹图谱相似度的测定，12批样品的相似度分别为0.974, 0.999, 0.999, 0.995, 0.997, 0.998, 0.993,1.000, 1.000, 1.000, 0.979, 0.959。混淆品的鉴别，对市场常见的灵芝抱子粉混淆品慧项仁油、鸦胆子油、山茶油、米糠油、花生油、 葵花籽油、

25、芝麻油、大豆油、菜籽油和橄榄油共10个品种植物提取油， 按试验确定方法和色谱条件制备供试品溶液，进行 HPLC-ELSD色谱检测，各混淆品图谱与灵芝抱子油指纹图谱可以明显区别。10 首次研究用HPLC-ELSD法同时测定破壁灵芝抱子粉中三油酸酯甘油等8个油脂类成分的含量。油脂类成分具有抗肿瘤活性且含量高，可作为灵芝抱子粉质量控制的指标性成分有报道采用高效液相 色谱蒸发光散射检测 （HPLC-ELSD）法测定了灵芝抱子油中三油酸甘油酯的含量、采用气相色谱法测定破壁灵芝抱子粉中油酸和亚油酸的含量方法。但对灵芝抱子粉或灵芝抱子油中的油脂类成分进行全 面系统的含量测定则未见报道。为此，本项目在分析灵芝

26、抱子粉油脂类成分的基础上，采用HPLCELSD法对灵芝抱子粉中的 8个油脂类成分进行含量测定的研究，为灵芝抱子粉全面的质量控制提供技术支 持和参考依据。因本品所测成分在紫外区基本无吸收，曾采用紫外检测器（205 nm作为检测波长）与 ELSD串联进行检测，结果紫外检测器所测得的彳t号响应低且基线噪音大，而 ELSD所得信号无论是峰形、响应 及基线噪音均较 UV法理想，故采用 ELSD进行检测。本研究比较了乙睛 -二氯甲烷、甲醇-异丙醇、 乙睛-异丙醇3不同的流动相系统，结果以乙睛-异丙醇（51 ： 49）等度洗脱时色谱分离最理想。另比较了石油醒（6090 C）、乙睛-异丙酉! （ 51 ： 4

27、9）不同提取溶剂，以及不同提取时间对含量的影响， 结果显示采用乙睛-异丙醇（51 ： 49）溶液回流提取 60min含量最高。还试验了不同柱温（25、30和35C）、不同色谱柱（Agilent Zorbax SB-C18、Kromasil C18 和 ACCHROM Unitary-C18 ，规格均为（250 mm x 4.6 mm, 5（im）对含量的影响，结果显示柱温及色谱柱对色谱峰的分离和油脂类成分的含量影响 较小。此外，对线性关系、精密度、稳定性、回收率等方法学进行了考察，结果均符合要求。25批样品含量测定结果（mg.g-1）：亚甘油三油酸酯（trilinolein ） 90%的样品为

28、3.06.9,最低1.9; 1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯（1,2-linolein-3-olein ） 90%的样品为 11.618.2,最低 6.2; 1,2-二亚油酸-3- 棕 桐 酸 甘油酯（1,2-linolein-3-palmitin ） 90%的样品为3.65.8,最低1.9; 1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯(1,2-olein3-linolein ) 90%的样品为 31.746.1 ,最低18.5; 1-棕桐酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯 (1-palmitin-2-olein-3-linolein ) 90%的样品为 18.229.8,最低 8.3;甘油三油酸酯(tri

29、olein) 95%的样 品为 52.079.0,最低 30.9; 1,2-二油酸-3-棕桐酸甘油酯 (1,2-olein-3-palmitin ) 90% 的样品为 23.363.7 , 最低34.2; 1,2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯(1,2-olein-3-stearin ) 90%的样品为9.017.4,最低5.6。结果显 示，脂肪酸成分中，甘油三油酸酯含量最高，1,2-二亚油酸-3-棕桐酸甘油酯含量最低。该结果为含量测定方法和限度的制定提供了依据。另有未破壁的 4 批灵芝抱子粉(批号为 LQ-20111001、LQ-20111003、LQD20111001、LQD-20111003)

30、 未能检测到8个待测成 分，主要是由于被稳定的灵芝抱子壁包覆，有效成分不能被提取所致。该结果提示，未破壁的灵芝抱子粉不宜使用。本文采用HPLC-ELSD法同时测定了破壁灵芝抱子粉中8个油脂类成分的含量，该方法简便、重复性、耐用性良好，可用于破壁灵芝抱子粉的质量评价。【佐证材料】论文：1赵维良，程夏倩，严爱娟，黄琴伟，徐靖，张文婷*.灵芝抱子油指纹图谱研究及 其混淆品鉴别J.中国现代应用药学，2017, 34(7):1011-1014.2程夏倩，周建良，高向波，张文婷*,赵 维良*. HPLC-ELSD 法测定破壁灵芝抱子粉中8个油脂类成分的含量J.药物分析杂志，2017,37(3):407-4

31、13.3张文婷，程夏倩，徐靖，黄文康，严爱娟，赵维良*. HPLC-ELSD测定灵芝抱子油中甘 油三酯的含量J.中国现代应用药学，2017, 34(5):719-722.4张文婷，徐靖，程夏倩，李明徭,黄琴伟， 郭增喜，赵维良*.灵芝抱子粉质量标准提高研究J.中国现代应用药学，2016, 33(6):799-803.标准：朱志泉，陈时飞，赵维良，王如伟，郭增喜，戚雁飞，宋剑锋，张文婷，等 .浙江省中药炮制规范 2015年版P336灵芝抱子粉。科技查新报告查新结论飞-2)、(3)。浙江省食品药品监督管理局标准起 草证明函。(三)延胡索物质基础和质控项目的研究，对延胡索水溶性非生物碱类化合物用三甲

32、基硅烷衍生 化GC-MS方法进行研究，首次从延胡索中鉴定得到核糖酸-1, 4-内酯、3, 4-二羟基-2-默基-吠喃等16个化合物，首次对延胡索水溶性非生物碱类化学成分分析检测方法进行研究，首次对延胡索酰胺类化 合物提取物及其制备方法进行研究，首次研究用HPLC-LC-MS/M 技术测定延胡索中的 12种农药残留。研究结果获得授权专利二项。1 .甲基硅烷衍生化 GC- MS对水溶性非生物碱类化学成分研究，文献报道延胡索所含的化合物 多为生物碱类化合物，大极性的醇、 酸、胺、单糖和低聚糖类等水溶性非生物碱类化合物报道的很少， 为了充分利用延胡索资源，进一步明确延胡索中该类化学成分组成，对延胡索8

33、0%乙醇提取物的大孔树脂水洗脱部位进行了系统的组分研究。在前期研究的基础上，水洗脱部位通过732阳离子交换树脂，分别收集水洗脱部分和5%氨水洗脱部分。这两部分的化学成分研究未见相关报道。对 732阳离子交换树脂水洗脱部分采取三甲基硅烷化衍生化，GCMS进行分析，通过与NI ST 2005标准谱库匹配，结合具体MS/MS质谱图进行分析的方法，首次从延胡索中鉴定得到水溶性非生物碱类化学成分核糖酸-1,4-内酯、3, 4-二羟基-2-默基-吠喃“和3型D-口比喃葡萄糖等16个化合物。并用质谱总离子流峰 面积归一化法测定了各成分的相对含量。以上数据分析结果在一定程度上反映了延胡索中水溶性非生 物碱类化

34、学成分，特别是含有羟基、竣基的化合物。该研究极大的丰富了延胡索的化学成分类型，也为延胡索质量控制提供了新的成分类型。为延胡索的深入研究和开发提供了科学依据。研究结果获得 授权专利二项。2 .非生物碱类化合物的分析检测，在延胡索的药效部位筛选研究中发现，延胡索的80%乙醇提取物过DA201大孔树脂柱，富集的纯水洗脱部位在药效学试验中表现出好的抗心肌缺血作用(大剂量， 350mg/kg ),本研究目的在于建立延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法。(1)取延胡索药材粗粉，60wt%90wt%乙醇溶液提取 24、次,每次乙醇溶液重量为延胡索药 材粗粉的48倍；优选方案为：取延胡索药材粗粉， 80

35、%乙醇溶液提取三次，每次乙醇溶液的用量为 延胡索药材粗粉重量的 6倍；提取液过DA201大孔树脂柱，收集 4倍柱体积的纯水洗脱获得的部位。(2)取(1)的水洗脱部位，干燥后称取干燥样品于衍生化瓶中，然后加入催化剂口比咤和硅烷化 试剂(99%BSTFA+1%TMS),于70c恒温反应1小时，冷却，得三甲基硅烷化反应溶液。(3)收集(2)的衍生化产物，采用气相色谱质谱联用方法分析，气相色谱条件为：采用非极性 毛细管柱；非极性毛细管柱；进样口温度：260 C;检测器温度：260 C;程序升温：初始温度 90 C,保持4分钟，以每分钟 6c升至200 C,保持5分钟，再以每分钟 10c升至250 C,

36、保持10分钟；载 气为高纯氮气，载气流速为每分钟1.9ml;分流进样，分流比 10:1;进样量：2M。质谱条件为：离子源温度：220C,传输杆温度：250C,电子轰击能量：70eV,灯丝电流：40 A,检测电压：2700V。最终可检测出约 50多种延胡索中水溶性非生物碱类化合物。按照色谱峰面积归一化法计算，其中磷酸占6.4%, 环己六醇占12.1%,乳糖占15.8%。3 .首次研究建立延胡索酰胺类化合物提取物制备方法0；既作为延胡索新的药用部位，亦为质控的 对照提取物。通过对延胡索的提取分离药理药效筛选研究，探索延胡索乙素等生物碱以外的具有心血 管活性和镇痛作用的有效部位，并研究其成分的质控方

37、法。研究结果发现了延胡索中新的酰胺类化合 物组分，具有心血管活性。其中2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯的含量为20-25%, 丁酰胺-4-乙酸酯等的含量为15-20%。进一步研究其提取分离方法，制备鉴别用对照提取物，为质控方法奠定基础。该酰胺类化 合物的结构通式见图 1,其特征是：R为含有玻基、羟基、酯基或氨基的烷基。在该组分中，以重量 百分比计算，2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯的含量为20-25% , 丁酰胺-4-乙酸酯等的含量为15-20% o提取方法包括以下步骤：(1)将延胡索药材的乙醇提取物过大孔树脂柱，收集纯水洗脱部位，用乙酸乙酯萃取，萃取后水层，用正丁醇萃取，收集正丁醇层，浓缩干燥即得酰胺类

38、化合物的组分，含量为50%以上。通过本方法提供的酰胺类化合物组分及所含的酰胺单体化合物可用于冠心病，心绞痛和心肌梗塞 等治疗。该研究提取分离的提取物，可以用作鉴别用对照提取物，为质控方法的进一步研究奠定基础。4. HPLC-MS/MS 测定延胡索中的 12种农药残留，延胡索药材多为人工栽培，其种植过程中多发的病虫害主要为霜霉病、菌核病、锈病和元胡龟象等，常用的农药有甲霜灵、乙烯菌核利、三口坐酮、 多菌灵、毒死蟀、氟虫睛、阿维菌素等。对延胡索中农药残留的测定曾有报道，其检测对象多局限在 有机氯类农药的测定，但由于该类农药已禁用多年，故结果多未检出或仅有痕量残留。笔者根据延胡 索病虫害 的发生和农

39、药的使用情况，并结合其种植区域环境所用农药等情况，选择了甲霜灵、三陛 酮、毒死蟀等12种常见农药作为检测对象，建立延胡索药材中的农药残留测定方法，对延胡索中农 药残留进行监测。通过供试品溶液制备、对照品溶液的制备、对照品和内标储备溶液的制备、色谱条件、色谱柱、 流动相、梯度洗脱、流速、柱温、进样量试验选择，通过质谱条件电离源模式、电离源极性、雾化气、 雾化气压力、扫描方式、检测方式、电喷雾电压、离子源温度、干燥气温度、干燥气流速等的选择试 验，并经各项分析方法的验证，比较不同的提取溶剂，结果用丙酮和甲醇提取较充分，但提取的杂质 多，净化难度大。用乙睛提取，极性大小较合适，提取效率较高，且能减少

40、对延胡索样品中亲脂性物 质的影响。另采用先加水浸润，再用乙睛提取，结果提取效率不及乙睛，且提取液颜色明显偏深，故 采用乙睛作为提取溶剂。考察比较了弗罗里硅土柱、石墨化碳氨基串联柱、PSA柱、TPH柱等不同固相萃取柱的净化效果，结果除在弗罗里硅土柱上有近半数的农药未被洗脱外，12种农药在石墨化碳氨基串联柱、PSA柱上的回收率未见显著差别，但采用后者回收率较集中，且净化效果较好，故选择PSA柱进行净化。另对洗脱溶剂和洗脱体积进行了优化比较，分别考察了乙睛、丙酮乙酸乙酯（1 ： 1）、3%甲醇的丙酮等不同洗脱溶剂以及不同洗脱体积，结果采用25 mL乙睛已可基本洗脱完全，并能达到良好净化效果。在PSA

41、柱上装入适量无水硫酸钠，以除去提取液中残余的极少量水分，可有效防止PSA填料的吸附性能下降。比较了 ZORBAX Eclipse plus C18、ZORBAX SB C18、shimpack ODS 等不同色谱柱，结果 ZORBAX Eclipse plus C18柱色谱峰峰形良好，保留时IW适中。采用梯度洗脱的方式， 提高了分析效率， 能在17 min内完成测定，并使各离子峰有较高的响应。从回收率数据上看，除敌敌畏的回收率在 65%68%,以及多菌灵在低浓度时回收率为78%外，其余农药回收率都在80%118%之间。敌敌畏回收率较低可能与其沸点较低、挥发性较强有一定相关，在氮气吹扫浓缩时一定

42、要在近干时立即用溶剂进行溶解。另从回收率结果的离散性上分析，RSD均5%,认为测定方法较为稳定，可以满足测定要求。按拟订方法对20批延胡索中农药残留进行测定，结果检出多菌灵、甲霜灵、三陛酮和辛硫磷，其余农药均未检出，从测定结果分析，12种农药中检出率最高的为多菌灵和甲霜灵，三口坐酮和辛硫磷有少量检出但含量均很低，检出量最高为多菌灵，且其含量亦均在0.04 mg kg-1以下，故认为延胡索的农药残留风险较低。【佐证材料】论文：1刘振华，王如伟*，何厚洪，姜迅知，叶剑锋，曾苏，胡季强.三甲基硅烷衍生化 GC-MS研究延胡索中水溶性非生物碱类化学成分J.中国中药杂志，2012, 37（14）:210

43、8-2112.2马临科，方翠芬，李文庭，赵维良*. HPLC-MS/MS测定延胡索中的12种农药残留J.中国现代应用药学， 2014, 31（4）:470-474.发明专利：1延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法 ZL201210037779.5 2 一种延胡索酰胺类化合物提取物及其制备方法和应用ZL201210068581.3.标准：朱志泉，陈时飞，赵维良，王如伟，郭增喜，戚雁飞，宋剑锋，张文婷，等.浙江省中药炮制规范2015年版P42延胡索。科技查新报告查新结论（4）、（5）。浙江省食品药品监督管理局标准起 草证明函。(四)首次以草乌的剧毒成分二酯型生物碱和有效成分单酯型生物碱为指标

44、，对浙江省草乌的传 统炮制工艺设计了正交试验研究，结果证实，浙江传统工艺水漂洗加豆腐煮的方法，可使剧毒成分二 酯型生物碱的含量下降，且下降程度与豆腐用量成正比，这一结论表明浙江省传统炮制方法比中国药 典收载不加豆腐水煮的方法科学，研究结果并为该炮制工艺提供了各因素的最佳水平。且用浙江传统 工艺炮制的制草乌其有效成分单酯型生物碱的含量比中国药典的更高，制订了比中国药典更高的限度，由中国药典的0.020%0.070,提高到0.020%0.15%。既保证了使用的安全性，又提高了有效成分的含量，提高了疗效。草乌为毛蔗科I!物北乌头 Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根，收

45、载于历版中国药典一部。性辛、苦，热，有大毒，功能祛风除湿，温经止痛。用于风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛及 麻醉止痛。因其有大毒，内服均需经炮制。其炮制方法众多，有水煮、润蒸或润煮相结合、润后蒸、 润后高压蒸、醋制、诃子制，另尚有甘草制、童尿制、酸奶制等方法，而浙江省中药炮制规范采用豆 腐制方法，但该法迄今未见有详细的工艺研究报道。本研究以草乌的毒性成分双酯型生物碱乌头碱(C34H47NO11)、次乌头碱(C33H45NO10)和新乌头碱(C33H45NO11)的总量及有效成分单酯型生物碱苯甲酰乌头原碱(C32H45NO10)、苯甲酰次乌头原碱(C31H43NO9)及苯甲酰新乌头原碱(C

46、31H43NO10)的总量为指标，以浸漂时间、水煮时间和豆腐用量 为考察因素，采用正交试验设计法对豆腐制草乌的炮制工艺进行优选。根据浙江省中药炮制规范，豆腐法炮制草乌的步骤为先用清水浸漂，再加豆腐与水共煮，取出草 乌，晾至半干，切片，干燥，其中关键因素为浸漂时间、水煮时间和豆腐用量。根据以往的经验和本 次初试结果，按使试验样品含量测定的结果分布于中国药典规定的单酯型生物碱上限和下限附近及双 酯型生物碱上限以下的要求，选用浸漂时间( A)、水煮时间(B)和豆腐用量(C)作为考察因素，每 个因素拟定4个水平，见表1,采用L16(43)正交试验设计对 A、B及C进行优选。三因素中对单酯型生物含量影响

47、大小的次序为漂洗时间水煮时间 豆腐用量。在上述任何条件下，毒性成分双酯型生物碱均小于中国药典的限度要求，均符合规定。豆腐法炮制草乌的最佳工艺条 件为A3B3C2 ,即浸漂6天，水煮5小时，豆腐用量25%。在浸漂时间为4天，煎煮时间为3小时， 不加豆腐时即AiBiCi条件下炮制，单酯型生物碱的含量最高，但远超过药典限度的上限。豆腐用量四水平实验结果，毒性成分双酯型生物碱总量分别为0.010%、 0.009%、0.004%和0.002%。毒性成分双酯型生物碱总量随豆腐用量的提高而下降。本研究结果有力支持了浙江省中药炮制规范草乌使用豆腐炮制的合理性。故浙江省中药炮制规 范2015年版未采用中国药典收

48、载水煮法，而采用了加豆腐煮的炮制法。【佐证材料】论文：1赵维良，严爱娟，黄琴伟，谭春梅，张文婷*.草乌豆腐法炮制工艺研究J.中国 现代应用药学，2018, 35 ( 1): 75-79. 2黄琴伟，郭增喜，马临科，张文婷，盛燕，陈浩，赵维良*.浙 江省中药炮制规范 2015年版中常用毒性中药饮片炮制方法浅析J.中国现代应用药学 ，2016,33(6):786-789.标准：朱志泉，陈时飞，赵维良，王如伟，郭增喜，戚雁飞，宋剑锋，张文婷，等.浙江省中药炮制规范 2015年版P64草乌。科技查新报告查新结论( 6)。浙江省食品药品监督管理局标准起草证明函。(五)土茯苓落新妇昔含量相关研究。百合科披

49、葵属Smilax药材含量测定存在的难题由来已久，土茯苓落新妇昔含量测定亦是其中之一。本项目研究解决了该问题。1 .首次探索出土茯苓样品间落新妇昔含量差别巨大的原因系产地不同，一种产于越南的根茎粗大，断面颜色发红的样品其含量与国产者差别尤其大。中国药典一部自 2005年开始制订了落新妇昔的含量测定，用 HPLC-UV 测定落新妇昔的含量， 并规定低限度为 0.45%。根据日常检验及文献报道，土茯苓落新妇含量测定结果差别巨大，最大的达 20倍以上，但一直未知原因。文献报道的对土茯苓落新妇昔含量的研究中，样品间含量差异较大，断 面色白者含量较低，多为0.2%0.6%;断面色红者含量较高，多为 1.0

50、%5.8%,后一类样品其性状与药典描述的“类白色至淡红棕色”不同，为深红棕色。2015年3月笔者对广东、广西、湖南的土茯苓商品情况做了调查，并采集了 5个省区的土茯苓样品进一步研究。经对浙江、湖南、广西、广东、江西等不同产地样品的分析，发现其饮片断面均为色白者，且直 径较小，含量较低；而断面色红，直径较大者不知产地，其样品间含量差别巨大，进一步至广西玉林 与越南接壤处，调查得知该药品系于越南走私进入。而国产样品间含量数据相对较为恒定。分析含量 测定结果可知，国内不同产地样品间含量差距相对较小，国产和越南产样品间的差距尤为明显。10批国产样品中，落新妇昔含量为0.1%0.6%,按中国药典一部的限

51、度判断，仅 3批符合规定，合格率仅为30%。越南样品5批，为0.7%5.9%,合格率为100%,且含量远远超过限度，有一批甚至超过限度10倍以上。越南产土茯苓落新妇昔含量均高于国产土茯苓，与文献报道的含量高者相近，文 献报道中未指明产地，我们推测文献报道中含量高者可能产于越南。有关土茯苓的研究中，样品的来 源十分重要，因饮片中常混入越南样品，故进行相关研究时应经具经验的研究者正确鉴定和分析。中 国药典将士茯苓中落新妇昔含量限度定为0.45%,而实际上国产土茯苓很难达到限度要求，反而越南样品全部合格，这就使得落新妇昔含量较低的国产土茯苓在市场上流通困难而促使含量较高的越南样品趁机进入广西后流入国

52、内某些省市。另对不同生长年限土茯苓含量进行研究，结果落新妇昔含量与生长年限也并无明显的相关性，说明生长年限并不是导致其含量差异的主要因素，其对落新妇昔含量的影响远小于产地。落新妇昔仅为土茯苓诸多成分之一，并非药效的唯一因素，故建议中国药典降低土茯苓中落新妇 昔的含量下限，并修改性状项，以杜绝越南走私土茯苓。2 .首次把落新妇昔(C21H22O11)热不稳定的性质应用于中国药典土茯苓含量测定方法的改进。研究发现中国药典方法落新妇昔含量测定数据不稳定，原因系落新妇昔对热敏感，加热提取时易转化为异 构体，改用超声仪提取的方法，即可防止此种转化，使测定数据变得稳定。按中国药典一部的土茯苓中落新妇昔(C

53、21H22O11)的含量测定方法测定，发现其落新妇昔平均加样回收率仅71.1%,方法的准确性较低。为探究方法中存在的问题及可能的原因，本项目按药典方法对 同一份样品不同回流时间的落新妇昔含量进行测定，结果随着回流时间的延长，其含量反而下降，故 推测问题环节为供试品溶液的提取，而可能的原因为落新妇昔的热不稳定性。原因分析针对回流提取过程中发现的问题，对落新妇昔的热稳定性进行了研究，以一定 浓度的落新妇昔对照品代替土茯苓样品，参照中国药典一部中的供试品制备方法，在85c的水浴中回流，分别于0、5、10、15、30、50和120 min时取样，按上述色谱条件测定落新妇昔的峰面积。结果显示， 随着加热

54、时间的延长，落新妇昔的峰面积也相应下降，50 min时，其峰面积仅有 0 min的65%。通过观察色谱图发现，其色谱峰也有所变化，5 min时即有转化，最后分解出4个色谱峰，根据落新妇昔 化学结构推测，其结构易转化，查阅文献，证实其热不稳定化合物，在加热过程中极易转化为其3个异构体。故进行不加热的超声提取进行比较，按上述两种方法分别于提取10、20、30、50、80和120 min时取样并测定落新妇昔含量，结果显示回流提取随着提取时间的延长，落新妇昔含量反而下降，超声提取在2050 min时提取效率较高，50 min后超声的提取落新妇昔含量开始下降，因随着超声时间的延长，提取液的温度开始提高，

55、超声提取的最佳时间为30 min。对比两者的含量测定结果，超声提取测得的落新妇昔含量均较回流提取的高，且提取时间较回流提取缩短了一半，表明改进后方法较原方法 提取效率更高，提取更完全。回流提取的平均加样回收率仅71.1%,而超声提取达到了 99. 3%,表明超声提取较回流提取的准确度高，更能反映土茯苓中落新妇昔含量的真实值。【佐证材料】论文：1严爱娟，郭增喜，张文婷，黄琴伟，戚雁飞，赵维良*.产地及生长年限对土茯苓 中落新妇昔含量的影响J.中国现代应用药学，2016, 33（6）:803-806. 2严爱娟，郭增喜，张文婷，黄琴 伟，戚雁飞，赵维良*. 土茯苓落新妇昔含量测定药典方法的改进J.

56、中药材，2016, 39（8）:1822-1823.标准：朱志泉，陈时飞，赵维良，王如伟，郭增喜，戚雁2飞，宋剑锋，张文婷，等.浙江省中药炮制规范2015年版P7 土茯苓。科技查新报告查新结论（7）。浙江省食品药品监督管理局标准起草证明函。（六）首次研究制定浙麦冬道地药材质量标准，制定的标准能有效区别川麦冬。浙麦冬与川麦冬 的原植物均为麦冬为百合科植物沿阶草（麦冬）Ophiopogon japonicas （L.f） Ker-Gawl.的的干燥块根。药材浙麦冬是著名的“浙八味”之一，原产于杭州宽桥、萧山、慈溪等地，与川麦冬的生长年限、和 质量均存在差异，外观性状和化学成分亦稍有区别。具有形状短

57、壮饱满，色泽黄亮、滋黏糯性、味甘 气清香的特点，优质地道，闻名国内外。但是市场上主要以川麦冬的产销为主，因为川麦冬与浙麦冬 的种植年限存在较大差异，川麦冬以栽后第2年收获作为药材，而浙麦冬以栽后第4年收获作为药材。为有效区别两者，对外观特征、显微鉴别、薄层色谱、指纹图谱、含量测定等测定内容进行了研 究，形成了浙麦冬质量标准，并作为一个药材规格收载于 浙江省中药炮制规范2015年版麦冬项下。 浙麦冬含有 6-醛基-7-甲氧基异麦冬黄烷酮B及Ophiopogonanone D成分，而川麦冬几乎不含该成分，浙麦冬的甲基麦冬二氢高异黄酮A及甲基二氢高异黄酮 B峰面积均比川麦冬要高。因此，以甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基二氢高异黄酮 B为参照物对浙麦冬及川麦冬的黄酮类成分进行了指纹图谱研 究，同时采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版（国家药典委员会）建立浙麦冬及川麦冬的指纹图谱，将两者进行比较研究。建立的指纹图谱，以浙麦冬指纹图谱为对照，对收集的浙麦