地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立

1、地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立【摘要】目的探计对地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞 培养的条件。方法用ms k 2和ms培养基对地钱配子体进 行愈伤组织诱导，运用模糊评判对msk 2培养基生长激素 组合进行综合性状评价。结果msk 2和ms均能诱导出地 钱愈伤组织，其中msk 2的诱导效果较好。光照能有效地 促进地钱愈伤组织生长。激素配比组合是?mg/l2,4 d+ 2?mg/lnaa+2?mg/l6 ba适合于地钱细胞生长以及次生代谢 生产。结论地钱愈伤组织的诱导成功和悬浮细胞培养条件的 建立，为探索药用苔薛植物次生代谢产物生产提供新的途径 以及对苔藓植物细胞规模化培养提供新的理论指导。

2、【关键词】苔藓；地钱；愈伤组织；植物细胞培养toinducec allustissuesandest ablishsuspensioncu ltureofmarchantiap olymorphal. methods msk 2andmsmediums wereusedtoinducega metophytesintocall ustissues,andthefuzzycomprehensiveevaluationmethodwasusedtoassesstheoptimalphytohormonecom bination. results b othmsk 2andms(2?mg /l6 b

3、a)mediums cou ldinducecallustiss ueformation,andthe msk2mediumwassuperiortothemsmediumforcallustissueinduction. lightintensitedthecallustissueohormonecombinatioecondarymetabolismd+2?mg/lnaa+2?tyeffectivelypromo growth. optimalphyt nforcellgrowthandsproduct i onwas?mg/l 2,4 mg/l6 ba. conclusions succ

4、essful induetionofthecallustissuesandestablishmeureofmarchantiapolewpathwayforexploralmosstoproducesecdnewtheoryguidanceureofmosscellsonal argescale.ntofsuspensioncult ymorphal. providean ingthepharmaceutic ondarymetaboli smart forsuspensioncultkeyword s:bryophyte；marcha ntiapolymorphal. ；cal lust i

5、ssue； cel leu lture 1材料与方法实验材料无菌材料获得及愈伤组织诱导 实验所用的地钱配子体由本实验室提供。将培养在温室 内地钱上的湿沙洗掉，流水冲洗2?h，在无菌室内用无菌滤 纸吸干，剪成?cm块状，放入7%nac10消毒2?min，无菌水冲洗3次，于培养温度为25?°c，光照时间12?h/d，光强为 5?000?lux的条件下。采用ms、ms和msk 2 7作为愈伤组织诱导培养基。以上培养基均添加琼脂，在高温灭菌 前ph值调至。悬浮培养条件的建立悬浮细胞经液体培养基继代培养5代以上，作为细胞种 子。选取 msk 2、ms、knop、wh ite、b5、miller

6、、1/2m sk 2和1/2ms等用于筛选悬浮细胞培养基，将筛选得到对细 胞生长良好培养基进行激素2,4d、naa和6 ba组合优化，以求建立对细胞生长和次生代谢合成均为有利的悬浮培 养条件。第20?d取样进行各生化指标测定，重复3次。实验方法光照强度的设定将固体培养愈伤细胞置于培养温度25?°c,光照时间 12?h/dhpg 35 ohx智能型植物生长培养箱内，分别设定光 照强度0、3?000、5?000和8?0001ux来考察光照对细胞生长 的影响。ph的测定采用phs 2型精密酸度计(上海雷磁仪表厂)测定。 叶绿素(chlorophyll )含量的测定 采用丙酮乙醇混合液法测叶

7、绿素含量8。将10?ml悬浮地钱细胞经3?000?r/min离心后，置于6?ml丙酮和无水 乙醇等比例混合浸提液中，放于暗处，室温下进行浸提， 652?nm处测定光密度，叶绿素含量用mg/g或mg/l?表示。细胞膜通透性的测定采用伊文思蓝染色法9。取l?g鲜细胞，用？ml%的伊 文斯兰溶液将细胞染色5?min后，pbs洗3次，以除去剩余染 料，然后用含1%sds的50%甲醇于50?°c下水浴30?min，以 抽提蓝色染料，在600?nm?下测定吸光值。酚类积累的测定取2?ml培养基滤液，加入10?ml乙酸乙酯，超声振荡 后静止萃取2?h，取5?ml乙酸乙酯组分自然风干后，残留物 溶于

8、3?ml75%乙醇中，在280?nm下测量其吸光度，以3?ml75% 乙醇为对照，以水杨酸为标准，以l?ug水杨酸在280?n m 处的吸光度代表一个单位的酚积累10。生化指标综合评价采用模糊隶属法用多项指标对激素配比组合进行综合评价：其中：u=u1，u211)为评价因素集，以0=1，2m； j=l, 2n)为评价值，i为处理，j代表各生物学性状。将各测得到的数据按公式r i j = (r i j -r j m i n) / (r j max-rj min) 处理，rjmin一指j性状中最小值；rjmax一指j性状中最大 值，得到评判模糊矩阵r。按照各性状的重要性确立各因素 的权重，得权重分配

9、集a，使权重满足归一化要求z ni=lwi=l，通过矩阵运算b=r at。统计学处理所有数据均以土s表示，应用sas统计学软件进行方差 分析，采用t检验进行显著性检验，以p为差异有统计学意 义。2结果地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养 见图1。由图1可见。msk 2培养基第15?d就可见在 地钱配子体周围已有深绿色愈伤组织产生，愈伤组织呈凝聚 状，不断增多，并向培养基四周扩展及培养基内渗入，配子 体不断缩小而愈伤组织愈来愈多。同样，培养在ms中的地 钱配子体周围也产生浅绿色的愈伤组织，只是其配子体缩小 缓慢，愈伤细胞生物量没有msk2培养基多。而在ms培养基的配子体第20?d仍未见愈伤组织的产生

10、。光强对地钱愈伤组织生长的影响 见表1。由表1可见，在光照3?000、5?000和8?000?lux 条件下，地钱愈伤细胞生物量显著高于未光照条件下地钱愈 伤细胞生物量。不同培养基对地钱悬浮细胞生长和叶绿素含量的影响见表2。由表2可见，knop培养基细胞生物量最高，其 次是msk 2，次之是ms培养基，而miller等培养基的细 胞生物量则要显著低于上述3种培养基。其中稀释培养基 1/2msk 2和1/2ms培养基的细胞生物量则分别低于msk 2和ms培养基。msk 2培养基生物量高于除knop外的其他培养基，其 叶绿素含量?g/l高于knop、mi her和ms等培养基。另外， msk 2培

11、养基诱导愈伤组织的效果比ms培养基要好，因此 本研究在msk 2培养基基础上，对其激素2,4d、naa和6 ba进行不同比例组合优化，以求建立对细胞生长和次生 代谢生产都较为有利的培养条件。不同激素组合对地钱细胞生长及次生代谢的影响见表3。由表3可见，表中序号1和3细胞生物量高于序 号10 msk 2，序号6、7、8和9要低于序号10，而序 号2、4和5细胞生物量与序号10没有区别。同样，对于叶 绿素含量来说，序号1和4叶绿素含量极显著高于序号10, 序号2、3、5、6和8叶绿素含量则显著高于序号10，剩下 的序号7和9叶绿素含量则要低于序号10。对次生代谢多酚含量来说，序号2、3、4、5、6

12、、8和9 多盼含量要高于序号10，而序号1和7多盼含量与序号10 差异不明显。各评价因素权重按照各性状的重要性确立各因素的权重，权重分配集a=to评价单元各评价因素的隶属度与综合评价指数见表4。由表4可见，序号3综合系数最大为？3，其次 是序号1，其综合系数为？6。最小的是序号6,其综合系数 为？9。3讨论本试验结果表明，地钱配子体在第15?d就诱导愈伤组 织，步聚简单，一步即可完成，减少了污染机会，优于文献 报道的方法11。本试验结果可为其他苔类及苔藓植物细 胞培养提供理论依据。光是调控植物生长发育的一个有效影响因子，高光强有 利于配子体启动并促进其诱导愈伤组织。本试验结果表明， 地钱愈伤组

13、织细胞受到光照后，有利于增加叶绿素含量和光 合效率，促进了细胞物质的吸收和代谢活动，有利于细胞增 埴，细胞呈鲜绿色，并很快长满培养基质，第20?d后培养 基上已长满一厚层的愈伤组织。但是光强过强容易造成细胞 光过氧化和破坏细胞叶绿体结构而降低光合效率，不利于细 胞增殖。虽然细胞在无光源照射条件仍能生长，但是细胞细 疏，颜色淡黄，其生物量显著低于光照培养，并且叶绿素含 量也低于有光照条件。虽然knop培养基生物量是最高的，但其叶绿素含 量?mg/l显著低于msk 2培养基的?mg/l和ms培养基 的?mg/l，而且knop培养基细胞在第20?d呈灰色，表明此 时细胞进行光合作用作用较差，因此不适

14、宜对地钱愈伤细胞 进行培养。稀释一倍的1/2ms和1/2msk 2的生物量也不如 msk 2和ms的好，故也不利于悬浮细胞增殖培养。msk 2培养基生物量仅低于knop培养基，而其叶绿素 含量显著高于knop、miller和ms等培养基。msk 2培养基诱导愈伤组织的效果优于ms培养基，因此本研究选择使用 msk 2培养基对地钱细胞进行悬浮培养。因msk 2培养基只含有2，4 d种植物激素，比 较单一 12 13。植物生长激素是最有效地调控细胞生长 的化学物质，若按一定比例组合可以达到增效作用，从而更 好地调控植物细胞的生长，因此本研究对主要激素配比进行 了优化处理。结果表明，激素配比组合序号

15、1和3对细胞的 生长最为有利，但它们细胞的其它生物学性状在各自同一生 化指标中并不是最好，说明仅从生物量来选择培养基不是很 准确。因此，本研究在建立不同激素配比组合为主的细胞培 养体系时，既考虑生物量的同时也兼顾与生物量和次生代谢 相关的一些事件，并运用模糊数学的方法对这些生化指标进 行综合评判。模糊综合评价分析法不仅考虑生物量，同时还 考虑与细胞生长和次生代谢相关的多个性状指标，较为全面 地综合分析和评价各激素比例组合，具有可靠性和客观性。本试验评价要素主要包括生物量以及与生物量和次生 代谢有关的生物学性状：如叶绿素、膜通透性、ph和多酚。 将各项指标的隶属函数的数值之和视为激素配比组合综合

16、 评价值，评价值大，配比组合效应好，反之评价值小，综合 配比组合差。序号3的综合系数最大，其生物量与序号1没有显著差异，其次生代谢显著高于对照序号10,其叶绿素含 量和膜通透性适中，有利于以后对细胞进行操作。因此确定， 适合于地钱细胞生长和次生代谢的培养基激素配比组合 是?mg/l2,4 d+2?mg/lnaa+2?mg/l6 ba,这为其他苔藓 植物细胞规模化培养提供了理论依据和指导。fanph. extraction,i icationofbibenzylp【参考文献】1 louhx,niuc,solationanditsappllagiochine：china,xx 824.2冷萍，郭秀

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