植物基因组DNA的提取及其定性定量分析

1、分子生物学实验报告实验一植物基因组dna的提取及其定性、定量分析【实验目的】通过木实验学习利用ctab法从植物组织屮提取dna并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分 光光度法对dna进行定性定量分析。【实验原理】ctab（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度 下（大于0.7mnacl），与蛋白和屮性多糖形成合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研 磨，从而破碎细胞。然后加入ctab缓冲液将dna溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去 除蛋白，最后经乙醇沉淀得到dna。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化dna片段的常川技术。把dna样品加入到一块包含电解 质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）

2、的样品孔中，并置于静电场上。dna分子在高于等电点的ph 溶液屮带负电荷，在电场屮向正极移动。dna分子在琼脂糖凝胶屮泳动吋有电荷效应和分 子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数的双链dna儿乎具有等馑的净 电荷，因此，在一定的电场强度不，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即dna分子 本身的大小和构型。dna分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小 的dna分子比分子量大的dna分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的dna分子，超螺旋质粒dna（cccdna0）最快, 其次为线状dna（l dna）,最慢

3、的为幵环质粒dna（ocdna）e核酸分子（dna或rna由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异 的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供丫 基础。1 od260相当于 dsdna 50 ng/ml，ssdna 33 pg/ml 和 ssrna 40 pg/ml。可以此来计算 核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值（a260/a280）估计核酸的纯度，若dna的a260/a280比值高于2.0,则 可能有rna污染，低于1.8则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂】

4、一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器（10、100、1000 gl 量程各一支）、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 1.5mlep管、pe手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基甲烷（tris）、ctab（ |六烷基三甲基溴化铵）、p-巯基乙醇、氯仿、苯酚、 乙醇、氯化钠（nacl）、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸（edta）、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、 核酸染料。三、试剂1. 2xctab buffer12. 70%乙醇【2】3

5、. rnasea （天根【3】4. 0.5xtbe缓冲液（工作浓度 15. 6xloading buffer6. 核酸染料（赛百盛）7. dna marker dl 2000（takara）8. 酚/氯仿（1:1, v/v） if l 【实验步骤】1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mlep管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2. 加入0.6ml2xctab提取液（用前加入0.2%的巯基乙醇），混匀，65°c水浴30min, 每10 min颠倒混匀一次。3. 収出离心管，冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液，混匀。4. 11,500 rpm室温离心8 min（若没离好可重复一

6、次）。5. 将上清液（约400 |il）转移到另一新的1.5 ml离心管中。6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，ll,500rpm离心8 min，取上清（约350 gl）。7. 加入600 |il无水乙醇，上下颠倒混匀，-80°ci30min。8. 4°c, 15,800 rpm 离心 20 min，弃上清。9. iml 70%乙醇（预冷）洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex, 7,000 g离心3 min, 弃上清，风干。10. 加入 30pl 无菌水（含 20pg/mlrnasea），37°c 溶角早 dna 30 min。11. 取5 pl dna样

7、品进行琼脂糖凝胶电泳检测：（1）制备琼脂糖凝胶称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶屮，加入30ml0.5xtbe缓冲液，置微波炉屮加热至 完全熔化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（2）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 待琼脂糖凝胶液冷却到60°c左右时，加入核酸染料1.5叫，摇匀，缓缓倒入有机玻 璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶而（注意不要形成气泡）。 室温下静置直至凝胶完企凝固（室温下30-45 min）,垂直轻拔梳子，取下胶带

8、，将 凝胶及内槽放入电泳槽中。 加入0.5xtbe电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。加样在点样板或parafilm上混合dna样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于lx。用10叫微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将dna marker分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶妞（注意：加样前要先记下加样的顺序）。（4）电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，dna片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。dna的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此, 最高电压不

9、超过5v/cm o 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿l-2cm处，停止电泳。 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。12.紫外分光光度法测定dna浓度及纯度：（1川o.lxte对待测dna样品按1:20或合适的倍数稀释。（2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现"instrument ready" 时，进入核酸测定窗口。（3）调零。先用o.lxte缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击"set ref键，仪 器白动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。（4）吸70叫己稀释的dna样品转入石英样品杯，放

10、入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用5-7 pl的石英样品杯。点zftenter"键，仪器即进入分析状态。窗口同吋显示260 nm和280 nm处的光密度（od值）及a260/a280 nm和a280/a260 nm的比率以及dna样品的浓度等。(5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加 入下一个待测样品。(6) dna纯度：以a260/ a280比值来反映。当a260/a280比值1.8时，说明样品存在蛋 白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残 留酚，冉用无水乙醇沉淀，te溶解后洱测定。当a26

11、0/a280比值2.0,说明样品存在rna 污染，可以用rna酶处理样品去除rnao实验结果与分析1. 1 %的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组dna1 %的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的dna 5(il样品，电泳结果如图所示c组电泳结果如图所有dna条带出现，表明己经成功提取到了拟南芥的基因组dna。2.dna样品的od检测检测0d值cl：浓度:1061.7 ng/od260/od280： 1.87表明：cl接种dna质量良好。（如下图所示）uleic kid lc:docu«ents and setting8o»ner.»fn0v0：ip0p1496b2o16,q5

12、-29-gp<c2：浓度:101t6ng/od260/od280： 1.86表明:c2接种dna质量良好。（如下图所示）c3：浓度:711.ong/od260/od280： 1.86表明:c3接种dna质量良好。（如下图所示）nucleic kcid icadocuwnui adan(u；dvour samplt and press thtbuttonsample o typeconepedestaldna 7110ng/pl *a260(10mmpalh)u220gaodtorvpcvtspedn，n縫 i5imcie volumea280(10mmpatf)7 665280/2801

13、86260/2301.s4basehne correction 34c nm注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中;2、取酚氯仿混合液吋要吸取下层；3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除洒精实验二pcr扩增目的片段【实验目的】通过本实验学习pcr反应的基本原理与实验技术。【实验原理】聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, pcr)是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似dna分子的天然复制过程，是将待扩增的dna片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后

14、，dna扩增2"倍。典型的pcr反应体系由如下组分组成：dna模板、反应缓冲液、dntp、两个合成的 dna引物、耐热dna聚合酶。pcr的工作程序实际上是一个在模板dna、一对已知序列的 寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，dna聚合酶依赖的酶促合成反应。整个 扩增过程分三步：变性，加热使模板dna双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段；退火，快速降低温度至50-60°c后，模板dna与引物按碱基配对原则互补结合，即 退火阶段，延伸，溶液反应温度升至72°c,耐热dna聚合酶以单链dna为模板，在引 物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸

15、(dntp),按5' 43'方向复制出互 补dna，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的dna 量就增加一倍，新形成的dna链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，dna可 扩增106-109倍。pcr扩增的特异性取决于引物与模板dna的结合。【仪器、材料与试剂】一、仪器及耗材pcr热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(0.1-2.5pl)、200 pl pcr管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器(10、100、1000 pl量程各一支、 100ml或250ml锥形瓶、兑简、点样板或parafilm、吸头、pe手套和乳

16、胶手套。二、试剂1. 10x缓冲液2. dna模板 1 ng/gl (以实验一提取的拟南芥基因组dna为模板)3. dntp mix (takara)4. 引物p3：5'-cgg gta ccg gtg aat taa gag gag aga gga gg-3'p5：5'-act cta gat gag taa aac aga gga ggg tct cac-3r引物溶液浓度：2pm5. rtaq 酶 5 u/pl6. 低熔点琼脂糖7. 去离子水或te （ph7.6）【实验步骤】1.在200 plpcr管内配制20 pl反应体系:反应物体积/plddh2o11.3lox

17、pcr缓冲液2.0dntp1.6 （终浓度 20200 pm引物12.0 （引物终浓度0.2（im）引物22.0 （引物终浓度0.2 pm）模板dna1.0rtag 酶0.1total20视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2. 将上述试剂依次加入pcr薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反 应成分集于管底。3. pcr反应热循环程设置： 94 °c预变性3 min; 94 °c 变性 30 sec; 64 °c 退火 30 sec;>30 cycles 72 °c 延伸 1 min;> 72 °c 延伸 lomin;© 16°cpause反应结束后短暂离心，賈4°