一株光合细菌的分离鉴定及污水处理能力研究

1、一株光合细菌的分离鉴定及污水处理能力研究周洪波，刘飞飞，邱冠周中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙410083摘要：光合细菌(photosynthetic bacteria,简称psb )是一种在自然界广泛存在的具有光能合成体系的原核微生物，除可用 作饲料添加剂外，还具有在好氧、微氧、厌氧多种条件下代谢废水中有机化合物、难降解卤化物等的能力，具有一定的工农 业应用前景。本实验以实验室废水处理反应器活性污泥为材料，采用液体富集培养、平板反复划线分离方法，得到一株光合 细菌，命名为psb-oo经菌落形态特征、细胞形态特征、活细胞光吸收光谱特征、生理生化特性及16s rrna基因分析，将 psb

2、-0菌株鉴定为rhodopseudomonas sp.o将该菌用于连续培养反应器处理合成有机废水试验，结果表明psb-0可以有效 去除合成有机废水中的cod ,在稀释率为().025 h-'时去除率达到最高62.8% ,可以用于有机废水处理。关键词：光合细菌；鉴定；生长特性；有机废水中图分类号：x172文献标识码：a文章编号：1672-2175 ( 2006 ) 05-0901-04光合细菌(photosynthetic bacteria ,简称 psb ) 是自然界中广泛存在、具有原始光能合成体系的原 核生物，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用， 现有19属约49个种川。psb可用作

3、饵料、饲料、 菌肥，还可生产生物降解塑料和杀虫剂等纟铁由于 光合细菌可广泛利用多种有机物在好氧、厌氧和微 好氧条件下进行多种方式的生长代谢，在有机废水 的净化处理中具有明显优势。psb不仅能够降解简 单的有机化合物，还能处理环境中较难降解的卤代 化合物和芳香化合物。目前光合细菌已在近几十种 有机废水处理中得以应用宀引。和传统活性污泥法相 比，psb处理法具有以下特点：有机质负荷高、设 备规模小、动力消耗低、占地面积小、脱氮除磷效 果好、管理简易，以及产生的菌体可综合利用，不 存在污泥处理问题等优点。因此利用psb处理高浓 度有机废水是非常有前途的环境微生物技术。作者 从实验室活性污泥样品中分离

4、到一株光合细菌，通 过形态和培养特征的观察、生理特征研究以及16s rrna基因序列分析，将菌株鉴定为rhodopseudomonas sp.；同时，对该菌处理有机废水的能力进行 了初步研究。1实验部分1.1光合细菌的分离与培养 液体富集培养基：ch3coona 3.0 g , ch3ch2coona ().3 g ,nacl 1.() g , (nh4)2so40.3 g , mgso4-7h2o 0.5 g , k2hpo4o.7 g , cacl2 0.05 g , mnso40.0025 g , feso40.005 g ,酵母膏 0.1 g，谷 氨酸1.() g ,蒸ts水定容至1

5、l ,调ph至7.4o 固体分离培养基：ch5coona3.0 g-l'1 ,酵 母膏 3.0 g-l'1 , cacl2 0.3 g-l1 , mgso4-7h2o 0.5 g-l'1 ,琼脂 20 g-l'1 ,调 ph7.4o采用液体培养和琼脂平板法相结合，反复多 次挑取单菌落进行培养以获得纯培养物。培养条 件：从本实验室依据连续进水周期循环活性污泥 工艺(cass )构建的污水处理反应器(反应器温 度25 °c , do质量浓度4 mg-l'1 ,连续稳定运行 30d)中取少量活性污泥样品于装有120 ml富集 培养基的125 ml血清

6、瓶中富集，置于光照培养箱 中30 °c培养，照度为2 000 lxo 69 d后，液体培 养基变为红色，经摇床振荡稀释处理后，涂布和 划线于平板固体培养基上，置于恒温培养箱中黑 暗好氧培养，7d后获得单菌落。在平板固体培养 基中重复划线3次以上，直到在显微镜下观察为 纯菌。1.2菌落及菌体形态观察观察平板上生长的单菌落；菌体形态采用普 通光学显微镜观察与扫描电子显微镜观察相结 合；电境型号为jeol jsm6380lv扫描电子显 微镜。1.3活细胞吸收光谱的测定取适量液体纯培养物在7 000 r/minxl0 min离 心洗涤3次，悬浮于“=60%蔗糖水溶液中，用岛 津uv3000型

7、紫外可见分光光度计在波长 300650 nm扫描。1.4生理生化特性测定1.4.1碳源利用试验以不含有机酸，且无生长因子的无机盐培养基 作为基础培养基(即除去乙酸钠、酵母膏、谷氨酸 的富集培养基)，分别加入最终质量分数为0.3%的 各种碳源，厌氧光照培养i4d后观察试验结果。1.4.2氮源利用实验用去除（nhsos谷氨酸、酵母膏的富集培 养基作为基础培养基在基础培养基中分别加入1 g/ l的下列氮源物质：蛋白月东、nh4ci、nano3等, 进行培养、观察。1.4.3初始ph值对光合细菌生长的影响将酵母膏和nh4c1减半的富集培养基灭菌后 调成不同的ph值，分别为5.5 , 6.3 , 7.2

8、 , &0。接 种后，用100 ml的生理盐水瓶，30 °c ,光照培养。 不同时间取样测定培养液的吸光度值（660 nm ）, 并用ph计测定培养液的最终ph值。1.5 16s rrna基因分析1.5.1菌体dna的提取细菌基因组提取采用上海生工生物工程技术 服务有限公司uniq-10柱式基因组dna抽提试 剂盒。1.5.2 16srrna基因的pcr扩増以所提取的细菌总dna为模板，在biometra 公司 tgradient thermocycler pcr 仪上进行 16s rrna基因扩增，所用引物为根据e.coli 16s rrna 基因第弘27位碱基和1510-

9、1492位碱基序列设计的 原核生物16s rrna pcr通用引物（正向引物 tdl:5r-agagtttgatcctggctcag-3'；反 向引物 rp2:5'- acggctaccttgttacgactt-3'）,引物由上海生工生物工程 技亲服务看限公司合成。pcr 反应体系 25 |1l ） ：10x pcr buffer 2.5yl ； mgc12 1.5 yl ； dntp 2 卩l ；模板 dna 2 卩l ；引物 fdl/ rp2 各 0.5 gl ； taq 酶（1 u/pl） 0.5 pl ；双蒸水15.5 plopcr程序95 °c预变性

10、6 min 94 °c变性1 min , 56 °c退火1 min , 72 °c延伸2 min ,扩增30个循 环；最后72 °c延伸10 mine taq dna聚合酶购自 fermentas 公司。1.5.3 pcr产物的回收pcr反应完成后，经w=%琼脂糖电泳，检测 扩增片段的大小和特异性，将目的片断切下，使用 omegae.乙n.a凝胶回收试剂盒纯化回收。1.5.4 16s rrna基因片断的克隆及重组子筛选将回收的目的片断克隆到promega公司的 pgem-t载体上，按照试剂盒说明书操作，通过 蓝白筛选，挑取白色菌落用lb液体培养基过夜培

11、养后用于测序，测序由上海博亚生物技术有限公 司完成。1.5.5 16srrna基因序列分析获得菌株16s rrna序列，用ncbi-blast软件 将测序结果在genbank等数据库中进行同源性检 索（http:/ncbi.nlm.nih. gov/bl ast 1.6光合细菌处理废水实验在一个容量为500 ml的连续培养反应器中， 以液体富集培养基为配方配制合成废水，化学需氧 量（cod ）为5 000 mg/lo通过调整恒流泵流速， 以调整稀释率,如 0.01 , 0.02 , 0.025 , 0.03 , 0.035 , 在各稀释率条件下运行到达稳态时（运行停留时间 的510倍）测培养液

12、的cod值，计算cod的去 除率，废水cod值采用重铅酸盐法进行测定。2结果与讨论2.1 psb的菌落形态分离到一株光合细菌命名为psb-o，在琼脂平 板上,30 °c黑暗好氧培养，7 d后形成圆形淡粉色菌 落，直径12 mm ,表面微凸，光滑湿润，边缘整 齐，有光泽。2.2 psbo的菌体形态学特征菌体呈短杆状或球状，二分分裂繁殖，革兰氏 阴性，有鞭毛，运动活跃。可在光照厌氧或黑暗好 氧条件下生长，菌体大小（0.4-0.7）卩mx（0.82.0） pm （图1 l2.3活细胞吸收光谱psb-0菌株活细胞在300-650 nm波长范围有320ku x20,0001 mm图1扫描电子显

13、微镜照片fig. i photograph of psb-o by sem特征吸收峰，分别位于370 nm、480 nm、590 nm（图 2 ,下页）。该其中370 nm处为细菌叶绿素a的特征 吸收峰,480 nm处为类胡萝卜素的特征吸收峰,590 nm处为细菌叶绿素b的特征吸收峰。由此认为： 本实验条件下,psb-o菌株活细胞中含有细菌叶绿 素a、细菌叶绿素b和类胡萝卜素。2.4 psb-0菌株生理生化特性2.4.1碳源利用富集培养基扣除有机酸成分后，分别加入单一 种类的碳源，观察在不同碳源存在的条件下菌体的 生长情况。结果表明，该菌株可以在草酸钠、甲醇、扫描波长./nm图2 psb-o菌

14、体活细胞吸收光谱fig. 2 absorption spectrogram of living psb-0 cell乙醇、淀粉、麦芽糖、乳酸钠、碳酸氢钠、葡萄糖、 柠檬酸钠、乙酸为碳源的培养基上生长，在添加丙 酮、丙酸、硫代硫酸钠的培养基上不能生长。2.4.2氮源利用不同氮源实验结果如表1所示，可以看岀， pbs-o菌株在添加了氯化鞍、谷氨酸、蛋白月东的培 养基上生长良好。而在以硝酸钠为氮源的培养基上 无法生长。2.4.3初始ph值对所分离菌株生长的影响初始ph值不同，psb-o菌株的生长状况不同。 表2显示，分离菌株的适宜ph值为6.3&0 ,以7.2 最好。在光照厌氧条件下培养的p

15、sb-o菌株，随时表1分离菌株对氮源利用情况hilbe 1 utilization of nitrogen source of strain氮源种类pbs-o氯化檢+硝酸钠-谷氨酸+蛋白籐+r表示该培养基上细菌无法生长；“+”表示该培养基上细菌能够生长间延长，培养液的ph值升高，最终ph值稳定在 &7左右。从表3可以看出，在不同初始ph条件下， 培养液变紫红色的时间(表示菌体浓度很高)同样 以初始ph 7.2条件下最短，为72 h ；而144 h后，表2不同ph值下光合细菌生长的观测(温度30 °c ,光照厌氧培养)tai be 2 influence on growth o

16、f pbs-o comes fromdifferent pl i of* medium初始ph值8.0细菌数/(lonil1)0.841.721.931.59最终ph值8.7初始ph 5.5条件下培养液仍未达到紫红色。2.5 psb-0菌株16s rrna基因序列分析测序后 得到长度为1 574 bp的菌株16s rrna 基因序列。序列对比的结果表明，所分离的psb-0 菌株与 genbank 中 rhodopseudomonas sp. v-1 的相 似性水平达97% ,结合菌株的形态学和生理学特 性，可基本确定分离的菌株为rhodopseudomona

17、s sp.o psb-o菌株的genbank序列登录号为： dq1263382.6 psbo菌株处理有机废水的初步研究在连续培养反应器中，不同稀释率条件下 psb-0菌株对cod的去除情况如表4所示。从中 可以看出，随着稀释率提高，光合细菌psb-0对有 机废水中cod去除率有一定提高，在稀释率为 0.025时达到最高62.8% ,再增加稀释率,由于 菌体停留时间缩短，对cod去除率下降。樊凌雯 等利用厌氧可溶化发酵-光合细菌(uasb-psb )四表4不同稀释率条件下psb-0对合成废水cod的去除率talbe 4 the cod removal of sjthetic wastewater

18、 by pbs-o under different dilution rates稀释率/0.010.020.0250.030.035出水 cod/cmg-l1)29862312186126013(x)6cod去除率/%40.3%53.8%62.8%48.0%40.0%级槽法处理糖蜜废液，codcr和bod5去除率分别 达95.33%和96.12%以上；郑耀通山等人比较了游 离光合细菌和固定化的光合细菌在改善鱼塘水质 方面的效果，发现在cod初始值为77.8 mg/l时， 化学需氧量自然去除率为33.7% ,加入游离光合细 菌后，去除率达到44.6% ,而固定化光合细菌则可 使cod去除率上升到

19、70.6%。王宇新问等人利用 光合细菌连续处理工艺，在适宜条件下进行淀粉废 水处理的中试研究，中试系统日处理量为4 m3 , codcr最大容积负荷6.17 kg/( m3 d ), cod去除率 达到95.7%o比较而言，本实验所用光合细菌psb-0 对有机废水cod有较强的处理能力，优化实验方 案后有希望进一步提高cod去除效果。3结论(i )从活性污泥中分离到的一株光合细菌 psb-0经过形态学、生理生化以及16s rrna序列 分析，鉴定为 rhodopseudomonas sp.o(2 )光合细菌psb-0在连续培养反应器中可以 有效去除合成有机废水中的cod ,在稀释率为 0.02

20、5 if1时去除率达到最高62.8% ,该菌株对有机 废水cod有较强的处理能力，可以应用于有机废 水的处理。参考文献：1 buchanan r e. bergey's manual of determinative bacteriolo- gym. baltimore, md: the willians and wilkins company, 1974: 16-29.2 吴永强，宋鸿遇.光合细菌固氮分子生物学研究逬展j.植物生理 学通讯，1991,27(3): 161-166.wu yongqiang, song hongyn. advance in the study on mo

21、lecular biology of nitrogen fixation in photosynthetic bacteria j. plant phy siology communication, 1991,27(3): 161-166.3 李勤生，谭镶清，王业勤.微生物饲料添加剂对养殖渔类的促进作 用卩.水生生物学报,1990, 14(4): 368-371.li qinsheng, qin deqing, wang yeqin. synergistic effects of microbial feedstuff additive on fish |j. acta hydrobiolog

22、ica sinica, 1990, 14(4): 368-371.4 nisson h, dundasi d. hodospirillum aalinarum sp. nov, a halo- philic photosynthetic bacterium isolated from a portuguese saltern |j|. arch microbial, 1984, 138(3): 251-256.5 李景生，黄韵珠.应用psb处理乳品厂废水的试验研究j.环境科 学研究，1997.10(3): 17-20.li jingsheng, huang yunzhu. experiment

23、al study on the application of psb in the waste water treatment of diary industry j. research environmental sciences, 1997, 10(3): 17-2016)樊凌雯，张笙铭.张徳咏.等.利用光合细菌处理糖蜜酒精发酵废 液中试研究j.中国环境科学，199& 18(2): 173-175.fan lingwen. zhang zhaoming, zhang dcwng, et al. a pilot text on the treatment of sugar-syrup

24、 alcohol ferment wastewater with photosymhetic bacteria j. china environmental science, 199& 18(2): 173-175.7朱核光，史家樑，徐亚同.光合细菌法处理酒糟废水的试验研究j. 上海环境科学.1995, 14(1): 8-10.zhu ileguang, sill jialiang, xu yatong. treatment of distillers grains wastewater using photosynthetic bacteria |j|. shanghai envir

25、onmental science, 1995,14(1): 8-10.|8陈繁忠，朱好根，崔明超.等.利用光合细菌处理养猪场污水的试 验研究j环境工程.2000, 18(5): 10-12.chen fanzhong, zhu haogen, cui mingchao, et al. experimental study on the treatment of devvage from piggery using photosynthetic bacteria j. environmental engineering, 2000, 18(5): 10-12.|9)水和废水检测分析方法|m. 3

26、版.北京：中国环境科学出版社. 1997.tlic method of detection and analyze of water and wastewater |m. 3rd ed. beijing: china environmental science press, 1997.10 刘如林.刁虎欣，梁风来.光合细菌及其应用m.北京：中国农 业科学技术岀版社.1991:94.liu rulin, di ao huxin, liang fenglai. photosynthetic bacteria and their application mj. beijing: china agri

27、cultural press, 1991: 94.11 郑耀通，胡开辉.固定化光合细菌净化养鱼水质试验j.中国水 产科学，1999,64(5): 55-59.zeng yaotong, hu kaihui purification of water quality by immobilized photosynthetic bacteria for fish culturing j. journal of fishurnal of fishery sciences of china, 1999,64(5): 55-59. ri2i王宇新，刘春朝.光合细菌处理淀粉废水的中试研究卩.环境科学,19

28、95, 16(3): 39-40wang yuxin, liu chunchao experimental study on the treatment of amylum waste water using photosynthetic bacteria j enviro mental science, 1995, 16(3): 3940.isolation, identification and characterization ofa photosynthetic bacterium strainzhou hongbo, liu feifei, qiu guanzhouschool of minerals processing and bioengineering. central south university. changsha 410083, chinaabstract: photosynthetic bacteria (psb), with the system of photometric energy synthesis, broadly exist in the environment. they can be good forage additive and also improve wa