A型EGCG二聚体抗淀粉样蛋白聚集的机制研究

1、A型EGCC二聚体抗淀粉样蛋白聚集的机制研究本文以柿单宁主要特征结构单元表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG及其A 型连接的二聚体(A型EGC(二聚体)为研究对象,旨在阐明A型EGC二聚体具备 较强抗淀粉样聚集活性的原因。首先 , 我们通过 Thioflavin T(ThT) 荧光、 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic(ANS) 荧光、傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 、圆 二色光谱和透射电子显微镜等手段系统证实了 A型EGC(二聚体具有比EGC单体 更强的抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成及解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的效果 , 并 探究了 A型EGCG1聚体发挥抑制作用的

2、关键阶段。进一步通过构建PC12细胞模型研究了 EGC(和A型EGCG1聚体对牛胰岛素 淀粉样纤维神经细胞毒性的抑制作用和调节机制。在此基础上，以AB 40淀粉样多肽为模型,通过ESI-MS核磁共振、分子对接等研究手段探索 EGCG口 A型EGCG 二聚体与AB 40淀粉样多肽的结合方式和相互作用位点。主要研究结果如下:1.EGCG和A型EGCG1聚体对牛胰岛素淀粉样纤维形成 抑制作用的比较研究ThT荧光实验结果表明，牛胰岛素蛋白在pH 2.0的含20聽 酸溶液中孵育8 h可形成成熟的牛胰岛素淀粉样纤维。加入 EGC(和A型EGCG 二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维的形成均可发挥显著的抑制作用 ,

3、且抑制作用随着 多酚浓度增大而增强。相较于EGCG体,A型EGCG1聚体效果更好,当其浓度达到0.35m M时，可 完全阻止牛胰岛素淀粉样纤维的形成。透射电子显微镜观察结果与ThT荧光实验 结果相符。加入0.70 m M的A型EGCG1聚体后,在透射电子显微镜中观察不到淀粉样 纤维状结构，但有部分无定型聚集体形成。此外，采用动态光散射检测发现 A型 EGC二聚体可保护一部分牛胰岛素蛋白继续以单体形式存在 ,同时生成了粒径 约为 295 nm 的无定型聚集体。ANS荧光、FTIR和圆二色光谱的研究结果表明,A型EGCG1聚体可较好地保 护牛胰岛素蛋白的原始构象 , 阻止蛋白二级结构的改变及内部疏

4、水性氨基酸的暴 露。因此,我们推测与牛胰岛素蛋白单体结合并抑制蛋白结构改变是A型EGCG二聚体发挥抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成作用的机制之一。为了研究A型EGC二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键时期 ,在牛胰 岛素蛋白孵育过程的不同时期加入 0.70m M的A型EGCG1聚体,从结果中可以看 出，在0 h和2 h时加入0.70 m M A型EGCG1聚体可完全抑制牛胰岛素蛋白疏 水性氨基酸的暴露及牛胰岛素淀粉样纤维化聚集进程 , 并阻止原纤维的形成 , 促 进无定型聚集体的形成,这表明A型EGC二聚体不仅能够与牛胰岛素蛋白单体结 合, 还可与成核寡聚体结合 , 并破坏其原有结构 , 从而达到

5、使其丧失继续形成原纤 维的能力。然而,在4 h时加入A型EGCG1聚体仅能部分抑制牛胰岛素淀粉样纤 维的形成。因此，以上研究结果证实，牛胰岛素淀粉样纤维形成过程中的延滞期是 A型 EGC二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键阶段。2.EGCG和A型EGCG1聚体对成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚作用的比较研究 ThT荧光和ANS荧光检测结果 表明A型EGCG1聚体可显著减少牛胰岛素淀粉样纤维疏水性氨基酸的暴露，且A型EGCG1聚体的解聚效果强于EGCGI体。透射电子显微镜的观察结果可进一步证实 A型EGCG1聚体具有更强的解聚 成熟牛胰岛素淀粉样纤维的能力。通过SDS-PAG电泳和Bradford法

6、分别分析成 熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚产物分子量分布和上清液中可溶性蛋白含量变化 ,可 以看到牛胰岛素淀粉样纤维解聚后形成了大量的分子量为 10 k Da 到 250k Da 的聚集体,且A型EGC（二聚体加入后生成的可溶性蛋白浓度为加入 EGC（时的 3.68倍,这表明A型EGC二聚体不仅对已形成的牛胰岛素淀粉样纤维具有更好 的解聚效果 , 还能促进可溶性牛胰岛素寡聚体的大量形成。3.EGCG A型EGCG1聚体对由牛胰岛素淀粉样纤维诱导形成的神经细胞毒 性的抑制作用及机制选用 PC12细胞模型研究了 EGC（和A型EGCG1聚体对牛胰 岛素淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用。 MTT实验结果表明E

7、GC（和A型EGCG1聚 体可显著抑制牛胰岛素淀粉样纤维诱导产生的细胞毒性。相较于EGCG,理EGCG1聚体可更好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样 纤维引起的损伤。实验结果表明,相较于EGCG,/型EGCG1聚体可更好地保护 PC12细胞膜完整性，降低由牛胰岛素淀粉样纤维诱导的胞内过量 Ca2+活性氧 （ROS）和一氧化氮（NO）浓度,阻止线粒体膜电位下降,提高胞内过氧化氢酶（CAT）、 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化防御酶活性,抑 制细胞内凋亡诱导因子（AIF）和核酸内切酶G（Endo G）等凋亡相关蛋白的过量表 达。因此, 根据以上结果 , 我们推

8、测清除细胞内过量的活性氧 , 并提高抗氧化防御 酶活性是A型EGCG1聚体较好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒 性损伤的分子机制。4.以AB 40淀粉样多肽为模型研究A型EGCG1聚体较强的 淀粉样聚集抑制作用机理ThT荧光实验结果表明A型EGCG1聚体具有比EGCG 单体更显著的抑制AB 40淀粉样纤维形成的能力。30卩M的A型EGCG1聚体可完全抑制AB 40淀粉样多肽疏水性氨基酸残基 的暴露和AB 40淀粉样纤维化聚集进程。透射电子显微镜的观察结果可证实上述结论,30卩M A型EGC二聚体可促使无定型聚集体的形成,同时完全阻止AB 40 淀粉样纤维形成。未修饰蛋白光催化交联法和 MTT法的检测结果均证实A型EGCG1聚体可较 好地抑制AB 40寡聚体的形成及其诱导的神经细胞毒性。随后，我们采用荧光淬 灭、ESI-MS核磁共振和分子对接等研究手段检测多酚与 AB 40多肽之间的相互 作用机制，结果表明EGCGf A型EGCG1