四氢生物蝶呤缺乏症的快速诊断、治疗与随访

1、上海交通大学 硕士学位论文四氢生物蝶吟缺乏症的快速诊断、治疗与随访姓名：顾梅青申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：叶军20080401r221x突变导致严重型临床表型。（4） bh4缺乏症血（生物蝶吟+蝶吟） %明显低于正常对照组（7=6.350, p=0.000）,符合诊断；1例正常人血 各蝶吟浓度的实验批内cv （311%）,批间cv （1923%） o 结论 （1）对所有hpa患儿及早进行bh4缺乏症鉴别诊断，3个月内 治疗可改善预后；（2） p87s、n52s、d96n及ivslnt-291 a>g为中国人 pts热点突变,pcr-rflp提高基因诊断效率；（3）干血滤纸片蝶

2、吟谱分 析方法有望代替尿蝶吟谱进行bh4缺乏症诊断。关键词四氢生物蝶吟缺乏症，高苯丙氨酸血症，基因突变，高效液相 色谱法the fast diagnosistreatment and follow-upof tetrahydrobiopterin deficiencyabstractobjective to emphasize the importance of differential diagnosis of bh4 deficiency in patients with hyperphenylalaninemia to acquire the gene mutation spectrum

3、 of chinese and evaluate the outcome after treatment. to make it possible that all the tests for the diagnosis of bh4 deficiency can be completed only by using dried blood spots on filter paper.method (1) fast diagnose bh4 deficiency by pterins analysis in urine, measurement of dihydropteridine acti

4、vity and bh4 loading test. (2) determine gene mutations of bh4 deficiency by means of pcr-rflp and other techniques(3) administrate bh4 and neurotransmitter precursors and evaluate therapeutic effect. (4) develop the method for pterins analysis in dried blood spots on filter paper and establish refe

5、rence values and evaluate the application perspective.results (1) 73 bh4 deficient patients, including 71 6-pyruvoyltetrahydrobiopterin synthesis deficiecy(97.26%) and 2dihydropteridine reductase deficiency(2.74%), out of 640 hpa were diagnosed and the incidence is 11.41%. (2) 18 mutation types of p

6、ts gene were identified. the p87s(40.91%)> n52s(13.64%)、d96n(11.82%) and ivs lnt-291 a>g( 10%) mutations accounted for about 76.36% of the mutant alleles. the p87l mutation was reported fdr the first time in chinese mainland. the q13x> m80t、ivs4nt-2a>g> l93m、l127f、k131n mutations were

7、 novel. the r221x mutation and two novel mutations named p172l and c104y were found in qdpr gene. (3) 96.43% of those who receive therapy within 3 months after birth have normal intellectual development. the percentage was higher than those who received delayed treatment obviously. about 89% of pts

8、gene mutations and the p172l and r221x mutations of qdpr gene were associated with severe phenotype(3) (biopterin+pterin)% in bood spots is lower than that in urin obviously( 1=6.350，p=0.000), in accordance with the diagnosis theintraassay cv was 3% 11%. the interassay cv was 19%23% conclusion (1) n

9、ecessary to make the differential diagnosis in all hpa patients as early as possible. early treatment can improve the prognosis of those who receive within 3 months after birth. (2) the p87s, n52s, d96n and i vs lnt-291a>g mutations are hotspot mutations of chinesepts gene.pcr-rflp technique can

10、increase the efficiency of gene diagnosis(3)pterins analysis in dried blood spots on filter paper instead of urine may be a practical alternative option for the differential diagnosis of bh4 deficiency.key words tetrahydrobiopterin deficiency, hyperphenylalaninemia, gene mutation, high performance l

11、iquid chromatography中英文缩略词表bh4tetrahydrobiopterin四氢生物蝶吟hpahyperphenylalaninemia高苯丙氨酸血症pkuphenylketonuria苯丙酮尿症phephenylalanine苯丙氨酸pahphenylalanine hydroxylase苯丙氨酸轻化酶ptps6-pyruvoyltetrahydrobiopterin6-丙酮酰四氢蝶吟synthesis合成酶dhprdihydropteridine reductase二氢蝶睫还原酶gtpchguanosine triphosphate三磷酸鸟昔环化水解酶cyclohyd

12、rolaserflprestriction fragment length限制性片段长度多态性polymorphisml-dopalevodopa左旋多巴5-htp5-hydroxytryptophan5 羟色氨酸hplchigh performance liquid高效液相色谱分析chromatographyms/mstandem mass spectrometry串联质谱neo(n)neopterin新蝶吟bio(b)biopterin生物蝶吟iso(i)isoxanthopterin异黄蝶吟pte(p)pterin蝶吟pcdpterin 4a-carbinolamine蝶吟-4a-二甲醇

13、胺脱水酶dehydrogenasesrsepiapterin reductase墨蝶吟还原酶thtyrosine hydroxylase酪氨酸轻化酶tphtryptophan hydroxylase色氨酸轻化酶上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位

14、论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。保密口，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。（请在以上方框内打“3）学位论文作者签名：日期： 年 月 日指导教师签名：日期： 年 月 日口高苯丙氨酸血症(hpa)是最常见的常染色体隐性遗传的氨基酸代谢紊乱疾病， 可由苯丙氨酸轻化酶(pah)或辅酶四氢生物蝶吟(bh4)缺乏所致。pah缺乏症 根据血phe浓度分为轻度

15、hpa (血phe<600|imol/l)、轻度pku (血phe 600 1200pmol/l)和经典pku (血phe>1200|iimol/l) 1；根据血phe对bh4反应程度分为 bh4反应型与无反应型两类2o bh4是由三磷酸鸟昔(gtp)在三磷酸鸟昔坏化水解 酶(gtpch)、6-丙酮酰四氢蝶吟合成酶(ptps)和墨蝶吟还原酶(sr)的作用下合 成，作为辅助因子在参与芳香族氨基酸拜化酶即苯丙氨酸疑化酶、酪氨酸軽化酶 (th)、色氨酸轻化酶(tph)催化反应后，bh4被氧化为蝶吟-4a-二甲醇胺，再由 蝶吟-4a-二甲醇胺脱水酶(pcd)和二氢蝶咗还原酶(dhpr)还原

16、为具有活性的bh4 (图1)。上述任一种酶缺乏均可导致bh4缺乏症。根据biodef数据库数据(/bh4databasesbiomdb.asp)统计，bh4缺乏症最常见的是ptps缺乏，约占56%,其次为dhpr缺乏，约占31%；较少见 的为gtpch缺乏和pcd缺艺各占3.7%左右。bh4缺乏不仅影响pah的活性，使苯 丙氨酸(phe)代谢障碍而在体内蓄积，同吋又影响脑内神经递质，如多巴胺、5-疑 色胺的合成，临床可表现为不同程度的运动障碍、肌张力异常、顽固性抽痉、肢体 震颤、智能落后等神经系统症状。如仅予低/无苯丙氨酸饮食治疗，血phe浓度虽能降 至正常，

17、但上述神经系统症状日趋严重，因此，如不能得到及时诊断、对症治疗， 其临床症状比pah缺乏型更为严重，预后也更差。由于早期或不典型bh4缺乏症患者 临床难以鉴别，尤其新生儿期无特异临床表现，因此需通过尿蝶吟谱分析、红细胞 dhpr活性测定、bh4负荷试验进行快速的鉴别诊断，以及早明确诊断。bh4缺乏症 患者如在出生2个月内给予bh4、l-多巴和5-轻色胺酸的替代治疗，则可避免神经系 统损害的发生，改善预后。对酶相关基因突变检测能从分子生物学角度进-步证实 bh4缺乏症的诊断，探讨基因型与临床表型的关系，提供适当的治疗方案，避免严重的神经系统损害和智能发育障碍。gtpgtpch 新蝶吟三磷酸二氢新

18、蝶吟ptps6 丙酮酰四氢蝶吟生物蝶吟dhpr醍式二氢蝶吟sr酪氨酸色氨酸bh4苯丙氨酸pahthtphpcd酪氨酸l 多巴5 疑色氨酸多巴胺5 拜色胺图1四氢生物蝶吟代谢途径fig 1 the biochemical pathway of bh4 metabolism国外在hpa筛查、鉴别诊断、基因诊断及治疗等方面起步较早。19341938 年挪威医生发现了pku的发病机制及生化改变；1953年德国bickel采用低phe饮食 治疗pku； 1963年美国的guthrie医师首创细菌抑制法测定干滤纸片中血phe浓度， 并应用于大规模新生儿筛查；19751976年kaufman及leeming

19、分别报道了 ptps 缺乏症及dhpr缺乏症；1979年，瑞士的niederwieser等将bh4负荷试验应用于 hpa的鉴别诊断3, 1984年应用hplc进行尿蝶吟谱分析4； 1982年日本的arai等 开创了用干血滤纸片测定dhpr活性的方法5。在基因研究方面，编码ptps和dhpr 的基因分别于1992年6和1987年7,8被定位，随后相关基因突变类型逐渐被报道， 并不断发现新突变。我国的新生儿hpa筛查始于1981年，近26年来全国筛查覆盖率逐步提高。本 院内分泌遗传代谢病研究室于1987> 1996年分别研制成功国产治疗pku的低/无苯 丙氨酸奶粉，1990年起在大陆地区率先

20、开展了尿蝶吟谱分析，2002年起对hpa患 儿进行bh4负荷试验，2003年建立干血滤纸片dhpr活性测定，完善了bh4缺乏 症的鉴别诊断，并向全国推广，提供bh4缺乏症的诊断服务；近5年对门诊就诊的 hpa患儿常规地应用上述方法进行bh4缺乏症的鉴别诊断。1995年起逐步开展了 hpa/pku的基因突变检测、产前诊断等，至今已为40余例hpa家庭成功地进行了 产前诊断。本课题主要研究内容分以下三部分：第一部分：bh4缺乏症的快速鉴别诊断及基因诊断。通过对新生儿筛查或临床 高危筛查诊断的hpa/pku#,联合采用尿蝶吟谱分析、血dhpr活性测定、bh4 负荷试验进行bh4缺乏症的快速鉴别诊断，

21、并对确诊为bh4缺乏症患者抽提dna, 采用pcr-限制性片段长度多态性（rflp）方法快速检测热点突变等进行基因筛查诊 断，了解中国人bh4缺乏症的基因突变谱，为产前诊断打下基础。第二部分：bh4缺乏症的治疗、随访。对bh4缺乏症患儿采用bh4、神经递质 前质等治疗并定期随访（包括-血phe浓度、体格、智能发育评价），评估临床疗效、 治疗早晚与智"能发育的关系，并探讨基因型与临床表型的关系。第三部分：建立干血滤纸片蝶吟谱分析方法。建立干血滤纸片蝶吟谱检测方法， 建立血新蝶吟、（生物蝶吟+蝶吟）及其百分比正常值，探讨血、尿蝶吟谱相关性， 力争通过干血滤纸片进行全套bh4缺乏症的鉴别诊

22、断（即bh4负荷试验中血phe 浓度检测、蝶吟谱分析、dhpr活性测定）及基因诊断，能为外省市hpa患儿提供 全套的bh4缺乏症诊断服务。第1部分bh4缺乏症的快速鉴别诊断及基因诊断bh4缺乏症是由于苯丙氨酸等芳香族氨基酸轻化酶辅助因子bh4的合成或代谢 途径中某种酶的先天性缺陷而导致的氨基酸代谢障碍，患儿除表现为hpa外，脑内 神经递质合成障碍导致的肌张力低下为其主要临床特点。bh4缺乏症早期除血phe 浓度增高外无其他特异症状，易被误诊为pah缺乏型hpa,低/无苯丙氨酸特殊奶粉 治疗后虽能使血phe浓度下降，但仍出现进行性肌张力低下等神经系统损害症状， 延误了对症治疗的最佳吋机，预后不良

23、。如今全国各省市已逐步推广新生儿hpa筛 查，筛查诊断的hpa患儿无上述临床症状，故从临床上难以鉴别，因此对新生儿筛 查诊断或临床高危筛查诊断的hpa患者，联合采用尿蝶吟谱分析、血dhpr活性测 定、bh4负荷试验，使患者在1周左右即能明确bh4缺乏症的诊断，经新生儿筛查 诊断的患者在出生12个月内得到对症治疗。对确诊bh4缺乏症患者进行快速基 因突变检测，以从分子生物学角度证实诊断，同时得出中国人bh4缺乏症的基因突 变谱，了解基因型与临床表型相关性，为今后开展产前诊断打下基础。1.1材料和方法1.1.1实验对象自1981年至2008年2月，本院小儿内分泌遗传代谢病专科门诊就诊的来自全国29

24、个省市的1413例hpa/pku,其中经新生儿筛查诊断430例，其余因智能发育 落后、抽痉、头发黄就诊而诊断。在家长知情同意下进行bh4缺乏症的鉴别诊断试 验，并对诊断为bh4缺乏症患者进行基因突变检测。1.1.2主耍仪器waters 510 plus高效液相色谱仪(hplc)美国waters公司uv-2450型双光束分光光度计日本岛津公司梅特勒delta320ph计5415r小型冷冻高速离心机ptc-220 peltier thermal cycler pcr仪alphaimager(is-2200)数字凝胶图像系power pac3000电泳仪、电泳槽串联质谱仪api20001.1.3主要

25、试剂新生儿苯丙氨酸荧光测定试剂盒细胞色素c (cytc)6-甲基四氢蝶吟(6-mph4)还原型辅酶i(nadh+)生物蝶吟新蝶吟异黄蝶吟蝶吟taq dna合成酶takara la taq with gc buffergoldview核酸染料丙稀酰胺四甲基乙二胺(temed)10%过硫酸鞍(ap)tsp509邛艮制性内切酶bbv邛艮制性内切酶fo"限制性内切酶其他试剂使用分析纯瑞士梅特勒-托利多公司美 国 eppendorf公 司美国mj research公司美国自然基因有限公司美国bio-rad公司美国 perkin -elmer sciexinstruments k芬兰labsys

26、tems公司美国 sigma-aldrich 公司美国 sigma-aldrich 公司美国 sigma-aldrich 公司美国 sigma-aldrich 公司美国 sigma-aldrich 公司美国 sigma-aldrich 公司 美国 sigma-aldrich 公司美国promega公司takara生物技术有限公司北京赛百盛基因技术有限公司北京博大泰克生物基因技术有限公司 北京博大泰克生物基因技术有限公司 北京博大泰克生物基因技术有限公司 纽英伦生物技术(北京)有限公司 纽英伦生物技术(北京)有限公司 纽英伦生物技术(北京)有限公司 本研究所实验室提供1.1.4研究方法1.1.4

27、.1 血 phe 测定血phe测定的标本采用干血滤纸片。外周血3滴滴于干滤纸片上，每个血斑直径 >8mm,血滴自然渗透滤纸正反两面，自然阴干后4°c保存待检。用打孔器打下直径 3nmi的血片，采用荧光酶免疫法测定血phe浓度9；或血片经卬醇萃取、盐酸正丁醇 衍生后，用api 2000串联质谱仪进行血phe、酪氨酸及phe/tyr的测定10。血 phe> 120|jmol/l 者诊断为 hp a。尿蝶吟谱分析11,121）尿标本处理新鲜尿液收集于避光容器中后，立即加入抗坏血酸（10mg/ml尿），混匀后-20°c 避光保存或渗透5x5cm专用滤纸，阴

28、干保存。用4.7mm孔径的打孔器打下20个尿 滤纸片，加入双蒸水lml,以层析柱13检体过滤膜过滤，取上清液500pl,再加入 10mg mno2,离心过滤，测肌酹（cr）浓度，并以o.lmol/l hc1稀释，使cr浓度达 23mg/dl。2）尿蝶吟谱分析hplc分析条件为：xex： 350nm,入em： 450nm, 5%甲醇为流动相，硅胶能18 碳组成的色谱柱为固定想，柱温45°c,工作时泵压力为100150kg/cm2,流速为 lml/mino先将各种浓度的标准品注入hplc内，经检测器检测，显示出标准新蝶吟、 生物蝶吟、异黄蝶吟的峰面积。再逐个注入待测尿标本，得出待测标本的

29、蝶吟峰面 积，经统计处理，计算出待测样本新蝶吟（n）和生物蝶吟（b）的含量，并计算 b%b/（n+b）xl00%o3）结果判断不同年龄健康儿童尿蝶吟谱正常值见表1。ptps缺乏时，尿新蝶吟明显增加， 生物蝶吟明显降低，b%多<5%或测不出；少数b%<10%； dhpr缺乏时新蝶吟可正 常或稍高，b明显增加，b%增高或正常。表1不同年龄段儿童尿蝶吟谱正常值(mmol/mol cr)年龄新生儿26月6月10岁neopterin1.2 2.92().9 7.490.29-2.61biopterin0.42-1.921.73 3.680.35-2.67b%19.8-50.326.2 68.

30、442.7-.3红细胞dhpr活性测定5,131) 标本的采集和处理取末梢血2滴于s&s903滤纸上，血滴直径8mm,通透滤纸，阴干，置4°c冰 箱保存。用打孔器从滤纸片上打下2个直径为5mm的血片，放置eppendorf管内， 加().15mol/l氯化钾溶液400pl,振荡1 osec 23次即可，然后16 ooorpm离心3min。2) 原理与方法在无酶反应情况下的第一步反应是6-mph4与氧化型的高铁细胞色素c反应， 生成醒-二氢蝶吟(q-6mph2)和还原型的亚铁细胞色素c；在还原型烟酰胺腺卩票吟二 核昔酸(nadh)存在下，q-6mph2在dhp

31、r作用下被还原为6-mph4,后者再与高铁 细胞色素c反应，如此循环，亚铁细胞色索c生成量与dhpr作用下q-6mph2被 还原为6-mph4的量成正比关系。在37°c恒温下，用波长550 nm的双光束实吋比 色并记录，测得在单位时间内产生亚铁细胞色素c的nmol数，以间接地反映出 dhpr活性强弱程度。设置lomin内斜率较为平稳的一段时间中产生的吸光光度差 值(m),根据公式：駆相对应的时间)x95.24x2,计算血片中每分钟的平均dhpr 活性。每次检测同时测定正常对照标本，以得出待测标本dhpr活性为正常对照活 性的百分比；定期测定阳性对照标本以评估实验方法的可靠性。3) 结

32、果判断：正常人1.023.35nmol/min/5mm disc), dhpr缺乏症患者此酶的活性 很低或测不出(图2)。图2正常人与dhpr缺乏症患者dhpr活性测定曲线示意图fig 2 the dhpr activity curve of normal control and dhpr deficient patient bh4或phe+bh4联合负荷试验对基础血phe浓度phe>600pmol/l的患儿直接口服bh4 20mg/kg,分别于oh、2h、4h、6h、8h、24h采血测phe浓度；对已接受低(无)苯丙氨酸治疗和轻度hpa 患儿，其基础血phe<600

33、|limol/l者，进行phe+bh4联合负荷实验，先口服phe(100mg/kg),分别于oh、lh、2h、3h采血后再进行上述bh4负荷试验。ptps缺 乏症患儿在服bh4后26hlkphe浓度降至正常，dhpr缺乏症患儿血phe浓度约 8h后下降，或无反应。此外，对bh4缺乏症患者与部分bh4反应型pku、bh4无 反应型pku其bh4负荷试验进行比较，以观察各型hpa对bh4的不同反应。棊因突变检测1) 外周血白细胞的分离留取bh4缺乏症患儿及部分父母静脉血2ml,加入含6%右旋糖昔溶液(soopl) +2%乙二胺四乙酸(edta) /生理盐水溶液(100pl)的抗凝管混

34、合，静置lh分层， 上层液移至离心管内于水平离心机上离心(4°c, 3 ooorpm, 5min),弃上清液，用 生理盐水洗涤3次：加入8oo)lil双蒸水，用吸管吹打约lmin,再加入1.8%氯化钠 溶液800pl,离心(4°c, 3 ooorpm, 5min),弃上清液。2) 基因组dna抽提分离出的白细胞内加入600pl白细胞裂解液，吹打均匀后加入蛋白酶k (终浓度500pg/ml)和十二烷基硫酸钠(sds)(终浓度1%) , 37°c水溶过夜；加入等体积 的酚/氯仿抽提一次，于水相加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀后 置-20°c

35、 11夜；4 5 000rpmocm5min； 70%冷乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，加80 looplte溶液(lommol/ltris hcl, 0.1mmol/l edta, ph 8.0),测吸光度a值， 调节dna浓度至200pg/mlo -20°c保存。3) pcr反应a. 引物设计ptps基因(pts) 6个外显子的引物设计见表2。dhpr基因( qdpr ) 7个外 显子的引物设计见表3。表2 pts基因外显子引物序列、退火温度、产物名称及大小引物引物序列退火温产物产物大名称度()°c名称小(bp)pts-llaf:5，-ggtggtaaggtctcatag-

36、3'54ii844r:5' -ctgtgtccgtaagttttcc-3,pts-elbf： 5'-agcaccgcagacagcgccgggaa-3'63el232r：5,-atcaggatgctggaggccgtccga-3,pts -e2bf'：59-ttctgactctccctttggtgagct-3962e2327r：5-gc attc ac actgtgtccgtaagtt3pts -e3bf：5' -gtatgttgctaacttgtgcttgg-3'55.5e3275r：5-aacactttggtagaggagaggcct

37、-3'pts -e4bf：gcacagtctctgcacattgtactg-3,56.5e4250r：ggaaccttaggagataactggttg-3'pts -e5cf：5 -t agtggcta agtg at a ag-355()e5543r：5,-tcaaacacagaaagaaac-3,注：a：扩增部分lntronl14;b：参考引文15； c：联合扩增exon5和exon616；f：上游引物;下游引物表3 qdpr基因外显子引物序列、退火温度、扩增产物名称及大小引物引物序列退火温产物产物大名称度()°c名称小（bp）qdpr -e1 af；5，-cgg

38、agccgggctggc agg ag3'72el165r;5,-ccgcggagacccagcagcc-3,qdpr -e2af； 59 -ta acc a a agctgttttctcc-3958e2189r;5,-gaacatacagccagtggtc-3,qdpr -e3af；5' -agatgcttagcctgtgttg-3,54e3224r;5,-ccaatccttgtcagctgga-3,qdp r-e4bf；5，tttcctgggaatgctgagc356e4212r;5,-aagcaaccccactccacaa-3,qdpr -e5af；5'-agtg

39、gtcactgagccatct-3'53e5165r；5,-acgggaaccccaagcactt-3,qdpr -e6af；59 -cgctgaatgcgtgcttatct-3'55.8e6158r;5, -ctggaagctgctcagtcatg-3'qdpr -e7af；5-ggtcagcatgtgcccagattt356e7214r;5' -tagtgacttttctggcagg-3'注：a：参考引文17； b：参考引文18； f：上游引物；r：下游引物b. 全血pcr反应条件50|dlpcr反应体系（除 pts-e和 qdpr-e）:基因组dn

40、a2pldntps4pl5xpcr buffer （含mg2+）lopltaq酶0.25|nl上游引物(125pmol/pl)1.5|nl下游引物(125pmol/pl)1.5|nlddh2o30.75plpts-e 50（hl pcr反应体系：基因组dna2pldntps4yl5xpcr buffer （含mg2+）10pl二甲亚飒dmso5pltaq酶025pl上游引物(125pmol/»l)1.5|lil下游引物(125pmol/»l)1.5|lilddh2o3o.75plqdpr -e l 50pl反应体系:基因组dna2pldntps8|nl2xgc buffer

41、 i （含mg2+5mm）25pltakara la taq 酶0.25pl上游引物(125pmol/pl)1.5|il卜游引物（12.5pmol/|il）1.5|ilddh2o11.75pl扩增条件：pts-e1 e4 和 qdpr -e2 e7：95 °c预变性94°c变性(温度见表1、表2)退火72°c延伸72°c延伸ptsj1、e5：95 °c预变性94°c变性(温度见表1、表2)退火72°c延伸5min30sec30sec 35cycles30sec5min5min40sec40sec 35cycleslmin5m

42、in72°c延伸qdpr -e l:94°c预变性lmin94°c变性30sec72°c退火兼延伸30sec35cycles72°c延伸5minc. 干血滤纸片pcr反应用70%乙醇清洁3mm孔径的打孔器在干净滤纸片上打洞10点以上，然后打2 个3mm待测血片在pcr管中，加入20pl现配的100%甲醇和100%丙醇1:1混合液， 浸透血片；在pcr管盖子打开状态下置60°c烘箱1015min干燥以固定血红素；加 入50pl0lxte缓冲液（ph&o）,经水浴（95 20min°c、60 10min°c,重

43、复一次），4°c 过夜；取萃取液510yl作为模板进行pcr扩增，循环37圈。4）琼脂糖凝胶电泳a. 配制1.8%琼脂糖凝胶称取2.34mg琼脂糖粉于三角烧瓶内，加130ml 0.5xtbe电泳缓冲液后放入微波 炉内加热至熔化，冷却至约60°c时加入goldview4pl,混匀后倒入制胶模具中，凝 胶厚度一般为0.30.5cm,迅速在模具一端安插上梳子，检查有无气泡，待凝固。b. 电泳胶凝固后小心移去梳子并置于电泳槽中，加入0.5xtbe电泳缓冲液，让液面高 于胶面1mm以上。pcr产物4pl加上适量缓冲液（0.1%混酚蓝，1%sds, 3.7%edta, 50%甘油），混

44、匀后加入加样孔内。接通电源，红色为正极，黑色为负极，核酸样品 由负极向正极泳动，电压100v,电泳1530min, pcrmaker作为分子量对照。5）ptps缺乏症基因诊断a. pcr-rflp分析根据文献报道ptps缺乏症患者80%基因突变类型为n52s、p87s和d96n,故 对ptps缺乏症患者首先采用pcr-rflp分析方法进行上述热点突变的快速筛检。 采用tsp509 i酶对e2 pcr产物酶切以检测n52s突变；采用bbv i和fok i酶对e5 pcr产物酶切分别检测p87s和d96n突变。限制性内切酶酶切反应10pl反应体系:1 ox缓冲液ipl限制性内切酶0.25plpcr

45、产物3plddh2o5.75|nl反应条件:e2/tsp509 1：65 2h°ce5/bbv i及e5/fok i： 37 2hr°c65°c(page)的配制用棉球蘸丙酮将玻璃板擦拭干净后装配至专用支架上，取40%凝胶贮备液（29g 丙烯酰胺和lg甲叉-双丙烯酰胺加超纯水至100ml） 1ml、5xtbe各lml、ddh20 3ml 加至10ml量桶内，混匀，加入aplopl和temed5pl,充分混匀后迅速注入玻璃 板间隙中，插入梳子，小心避免混入气泡，放置室温下待其凝固。 电泳凝胶充分凝固后拔出梳子，用ddh20冲洗梳孔以除去耒聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电

46、流槽，加alxtbe电泳缓冲液至将凝胶完全浸没，取4»l酶切产物加至梳 孔内。e2/tsp509 i酶切产物电泳loomin,电压60v； e5/bbv i及e5/fok i酶切产物 电泳120min,电压80vo 银染小心取下凝胶放入装有100ml 10%乙醇溶液的塑料容器内，在摇床上摇5min,用ddh20洗涤3次，加入1%硝酸溶液100ml,摇5min后用（wh2o洗涤3次，加入0.2%硝酸银溶液100ml （含75pl甲醛），摇5min后用ddh2o洗涤3次，加入3%碳 酸氢钠溶液100ml （含75plrp醛和igl 100mg/ml硫代硫酸钠溶液），摇至核酸条件 显现，用

47、ddh20洗涤3次后用1%硝酸溶液固定5min,拍照分析。 酶切结果判断n52s：无n52s突变的e2存在3个tsp509 i酶切位点，酶切后产生33bp、ll lbp、 68bp和115bp四个条带（实际电泳后lllbp和115bp两条带很难分开），n52s突变 者因失去1个位点，酶切后产生33bp、lllbp和183bp三个条带。p87s：无p87s突变的e5有1个bbvl酶切位点，酶切后产生127bp和416bp两条带，p87s突变者失去此位点，仅产生543bp条带。d96n：无d96n突变的£5有1个卩0灯酶切位点，酶切后产生158bp和385bp两条带，d96n突变者失去此

48、位点，仅产生543bp条带。b.pcr产物纯化、测序对用快速酶切法找到上述3个热点突变的ptps缺乏症患儿，pcr产物由上海棊康生物技术有限公司或上海生工生物工程技术服务有限公司纯化、测序加以证实； 对快速酶切法未能找到突变的患儿，采用pcr扩增pts基因所有外显子及部分内含子1,直接测序进行突变检测。6）dhpr缺乏症的基因诊断对dhpr缺乏症患儿，pcr扩增 qdpr 7个外显子，pcr产物直接测序。7）排除多态对发现pts或qdpr基因新变异者，进行反向测序，同时对父母进行该突变的检测以证实；另对50个正常对照者进行相应突变位点测序或采用rflp方法，以排 除多态性。1.1.5统计学分析

49、应用spss 11.5统计学软件，采用厂检验法对bh4缺乏症与pah缺乏型患儿之间、bh4缺乏症三个年龄组（v3月、312月、>1岁）患儿间初诊时血phe浓度进 行差异显著性分析，实验数据用均值土标准差（mean土sd）表示，p<0.05有统计学意义。1.2实验结果1.2.1 bh4缺乏症的鉴别诊断 bh4缺乏症的发病率及分布情况本研究室1990年逐步开展尿蝶吟谱分析等鉴别诊断，专科门诊1413例hpa中 640例患者做尿蝶吟谱分析等鉴别诊断试验，结合dhpr活性测定，诊断bh4缺乏 症73例，bh4缺乏症在hpa的发病率11.41% (73/640)。其中71例为p

50、tps缺乏 症(男40例，女31例)，2例为dhpr缺乏症(男)，分别占bh4缺乏症的97.26 %和2.74%o 71例ptps缺乏症患儿出生于69个无关联的家庭，其中4个家庭中一 家2例。所有bh4缺乏症患儿出生地分布见表4,其中2例dhpr缺乏症患儿分别 来自江西和安徽，无血缘关系。表4 bh4缺乏症出生地分布出生地病例数%出生地病例数%上海810.96福建79.59江苏1114.07山东79.59浙江56.85河南22.74江西1419.18安徽68.22四川11.37广东11.37湖北22.74湖南56.85黑龙江22.74辽宁11.37贵州11.3 血phe浓度bh

51、4缺乏症患儿筛查或初诊时的血phe浓度为715.92±413.34|nmol/l (125.4 1953pmol/l),本研究室筛查诊断的120例pah缺乏型hpa患儿筛查或初诊时血phe 浓度为858.15±548.52|imol/l (124.82154ymol/l),两者差异无统计学意义(3.657, p=0.083) o <3月、312月、>1岁诊断的三组bh4缺乏症患儿其筛查/初诊吋的血 phe浓度分别为708.26±4274|nmol/l、97236±47362pmol/l、764.4±364.94|nmol/l, 差异

52、无统计学意义(f=2.016, p=042) o bh4缺乏症患儿中血phe浓度v360pmol/l 占 18.03%, 3601200jnmol/l占68.85%, >1200|limol/l占 13.11 %。尿蝶吟谱分析71例ptps缺乏症患儿尿新蝶吟浓度为(12.69±11.14)mmol/mol cr(0.38 38.7)mmol/mol cr> 生物蝶吟浓度为(0.15±0.17)mmol/mol cr(00.97 )mmol/mol cr 及生物蝶吟百分比(b%) (1.75±187)%(09.7%),有4例分别于bh4负荷

53、试验前及后 46h留尿作蝶吟谱分析，其平均b%由服前的1.25%上升至服后的46.12%,进一步 支持诊断。2例dhpr缺乏症患儿的尿新蝶吟分别为2.92mmol/molcr和1 immol/molcr,生物蝶吟分别为7.44mmol/molcr和 1331mmol/molcr, b%分别为 71.79%及54.66%； 口服bh4后46 h尿b%较前明显增高，分别为92.28%和92.43%。血dhpr活性测定ptps缺乏症患儿的血dhpr活性为(3.44±1,22)nmol/min/5mm disc(1.2 5.83)nmol/min/5mmdisc； 2例dhpr

54、缺乏症其血dhpr活性均为0.27nmol/min/ 5mm disc,分别为正常对照者的6.11%和7%,明显低于正常。bh4负荷试验结果ptps缺乏症、dhpr缺乏症、bh4反应型pku(血phe浓度在口服bh4后在24 小吋内降至基础值的30%以上)及bh4无反应型轻度pku4组患者bh4负荷试验 显示其血phe浓度对bh4的不同反应(图3)。ptps缺乏症患儿服bh4后血phe浓 度迅速下降，2h时下降64.23%, 4h吋下降88.62%,达正常水平；2例dhpr缺乏 症患儿的血浓度下降较慢，2h时仅下降11.79%, 4h时下降32.45%,至24h仅下降 了56.2

55、2%,未能降至正常，下降曲线与bh4反应型pku相似；bh4无反应型轻度 pku患儿血phe浓度无明显变化。1000.0()900.00 l)800.001z 700.00 o1/600.00 pm 500.0() 400.00 hei&o.oo 血 roo.ooioo.(x)0.00轻度 pku(n=48)bh4 反应性 pku(n=93)ptps 缺乏症(n=71)dhpr缺乏症(n=2)0246824口服bh4后时间(h)图3各型hpa血phe浓度对bh4负荷试验的不同反应fig 3 reaction of defferent forms of hpa in bh4 loadin

56、g test1.2.2 bh4缺乏症的基因诊断 ptps缺乏症基因诊断1) ptps缺乏症患儿基因分析情况71例ptps缺乏症患儿中的55例(53个家系)接受了基因检测，其中51例采用外周静脉血抽提dna为模板进行pts基因突变检测，4例采用干血滤纸片淬取液为模板进行基因突变检测。50例患儿两个等位基因均检出突变，其中36例(占72%) 携带杂合突变，14例(占28%)携带纯合突变；5例仅检出一个突变基因。通过 pcr-rflp方法进行 ms基因3个热点突变(n52s、p87s、d96n)的快速检测， 发现26例携带两个热点突变，20例携带一个热点突变，分别占总检出例数的47.27% 和 36