CHO细胞表达抗体

1、1会计学CHO细胞表达抗体细胞表达抗体酵母细胞哺乳动物细胞昆虫细胞CHO 细胞细胞骨髓瘤细骨髓瘤细胞胞分泌内源性蛋白；可用无血清培养DHFR缺陷型宿主细胞野生型宿主细胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec载体系统Life Technology公司GS基因表达系统基因表达系统瑞士的Lonza公司DHFR基因表达系基因表达系统统Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主细胞：DG44质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR标记基因，￥3500）筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX

2、 （氨甲喋呤）宿主细胞：CHO-K1SV质粒：PEE12.4（Amp抗性，GS标记基因，￥2000）筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）宿主细胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标记基因，￥10000）筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO Cell作用环节作用环节相应策略相应策略整合位点弱化选择标致基因；染色体定位筛选基因剂量弱化的可扩增选择标志基因转录强启动子、增强子、强转录终止信号、适宜的抗体基因结构翻译翻译型增强子，适宜的抗体基因结构加工组装轻重链表达平衡，宿主细胞修饰分泌适宜的抗体分泌前导肽，适宜的抗体基因结构其

3、他选择适宜的宿主细胞、宿主细胞修饰，尽量去除非生产性克隆抗体mRNA的转录、转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素因此，抗体的表达量很大程度上由质粒载体的各表达调控元件及组织方式决定表达载体结构组成u 骨架序列u 选择性标志基因选择性标志基因u 表达盒表达盒u 特殊的调控序列大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因在原核细胞中大量扩增和制备原核基因原核基因序列序列在哺乳动物中有效的转录启动子、增强子元件、终止子PolyA序列在CHO细胞中大量表达目的蛋白真核真核基因基因序列序列抗生素类筛选标（Neo）细胞代谢类筛选标记(MTX MSX)筛选出稳定表达较多抗体的细胞株筛选标记筛选标记选择标志基因选择

4、标志基因共扩增基因共扩增基因（DFHR和GS）非扩增基因非扩增基因（neo）当环境中存在高浓度（MTX 、MSX）时，标记基因可自发在染色体上扩增拷贝数，连带其上下游的序列一起扩增，共扩增序列可达上千个bp，拷贝数可增加几百到几千倍。对目的基因的拷贝数没有影响，如主要用于构建瞬时表达载体。抗体基因表达盒的组抗体基因表达盒的组织形式已较为固定，织形式已较为固定，但其中各元件的选择但其中各元件的选择仍有值得探讨的地方仍有值得探讨的地方启动子启动子启动子下游有真核的核糖体进入位点，通常为GCCGCC A/GCCAUGG+4的共有序列IRES具有较强的起始翻译的能力，研究发现，某些动物的基因前存在类似

5、IRES的序列，可以独立启动翻译，并且翻译效率很高，可称之为翻译型增强子核糖体进入核糖体进入位点位点影响mRNA的有效合成和稳定性，提高胞浆中能进行有效翻译的 mRNA浓度，提高表达水平。使用广泛的有BGH polyA site，转录终止作用强于SV40.转录终止信转录终止信号和号和PolyA加尾信号加尾信号启动子和相应的增强子是最关键的元件真核启动子含有TATA盒（确定转录起始位点）和下游富含GC的序列（决定转录起始频率）常用的CHO细胞表达启动子的转录活性依次为C M V 启 动 子 SV40 启动子 LTR启动子 PcDNA3.3/Poptivec载体系统GS系统DHFR系统 常用常用的

6、较早的商业的较早的商业化载体系统化载体系统适用于适用于DHFR缺陷缺陷细胞，但是有报道细胞，但是有报道CHO（DHFR-)细细胞，很难驯化，生胞，很难驯化，生长也长也不好。不好。DHFR系统表达系统表达水平虽较水平虽较GS系系统低，但细胞统低，但细胞生长稳定生长稳定新近发展的更新近发展的更有效的有效的系统系统具有具有更高的扩更高的扩增增效率，效率，但细但细胞长期连续培胞长期连续培养时，生长状养时，生长状况不佳。况不佳。 将右图质粒共转染将右图质粒共转染CHO（DHFR-）u 宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长u 重组质粒Poptivec-target整合到宿主菌染

7、色体组上后的阳性菌可在不含GHT的培养基中生长。u 进一步用G418和MTX筛选，在MTX浓度选择压力下，dhfr基因与其共转染的目的基因一起扩增，提高目的蛋白表达。Sigma、药明康德等公司都在自己构建载体使用（只要知道载体的几个原件可以自己全部合成）宿主细胞：CHO-K1质粒：PEE12.4筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）瑞士的瑞士的Lonza公司公司 1992年，Bebbington等首次使用GS基因细胞系统表达重组抗体 PEE12.4PEE12.4412.4GS宿主宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked）培液培液：CD-FortiCHO Medium 限制性内切酶限制性

8、内切酶： AvrII/BstZ17I ，EcoRV /Pacl线性化酶线性化酶：NruI转化转化：Neon electroporation Transfection筛选试剂筛选试剂：Puromycin/MTX筛选方法筛选方法：两轮加压筛选单单克隆筛选克隆筛选：有限稀释法u 四氢叶酸是一碳单位的载体，在核苷酸的合成中起到重要作用。u 当叶酸类似物MTX不可逆结合后，阻止四氢叶酸合成。细胞必须产生更多的DHFR才能维持细胞代谢。DHFR（二氢叶酸还原酶）筛选原理u 小梯度多次加压有利于最终得到稳定的高表达细胞株。u 大幅度加压可以在短期内得到高表达克隆株细胞，但是细胞株表达不稳定，在撤掉筛选压力后

9、，表达水平往往下降。THEENDTHANK YOU ！分泌内源性蛋白；可用无血清培养DHFR缺陷型宿主细胞野生型宿主细胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec载体系统Life Technology公司GS基因表达系统基因表达系统瑞士的Lonza公司DHFR基因表达系基因表达系统统Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主细胞：DG44质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR标记基因，￥3500）筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主细胞：CHO-K1SV质粒：P

10、EE12.4（Amp抗性，GS标记基因，￥2000）筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）宿主细胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标记基因，￥10000）筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO Cell表达载体结构组成u 骨架序列u 选择性标志基因选择性标志基因u 表达盒表达盒u 特殊的调控序列大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因在原核细胞中大量扩增和制备原核基因原核基因序列序列在哺乳动物中有效的转录启动子、增强子元件、终止子PolyA序列在CHO细胞中大量表达目的蛋白真核真核基因基因序列序列抗生素类筛选标（Neo）细胞代谢类筛选标记(MTX MSX)筛选出稳定表达较多抗体的细胞株筛选标记筛选标记 将右图质粒共转染将右图质粒共转染CHO（DHFR-）u 宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长u 重组质粒Poptivec-target整合到宿主菌染色体组上后的阳性菌可在不含GHT的培养基中生长。u 进一步用G418和MTX筛选，在MTX浓度选择压力下，dhfr