Gateway反应体系

1、文中如未特别指出， pcr程序均为： 95预变性 5,95变性 30,60退火30, 72延伸 130 (短片段 30), 30个循环后延伸 10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测 pcr产物。1.1.1 载体构建及鉴定1pcr 产物的纯化参见安比奥生物科技公司的puprep pcr purification kit 说明书。2. 载体构建（ gateway技术）pdonr201是一种 attp供体载体，用于bp反应构建入门载体， 包含抗 kan和抗cm筛选标记，并且含有ccdb基因，ccdb基因编码干扰大肠杆菌 dna 促旋酶的一种蛋白， 从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。 当目的载体和入门克隆发

2、生重组时，ccdb基因被目的基因取代。携带有ccdb基因的未反应载体或保留有ccdb基因副产品的细胞将不会生长。gatewayn-gfp 一种attr目的载体通过 lr反应构建目的基因的表达载体（图3.3） ， 含有35s组成型强启动子、 抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因bar，还含有绿色荧光蛋白报告基因gfp。表达载体 gatewaypleela （图2.2）含有35s组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因bar，通过 lr反应构建目的基因的表达载体。图 2.2 pdonr201 的结构bp反应体系(attb x attp attl x attr ) attb-pcr产

3、物40-100 fmol,25-50ng pdonr?75ng 5x bp clonase? - buffer 1 lte buffer (ph 8.0) or h2o to 4.5lbp clonase?0 .5ltotal 5l反应体系放于 25 c下温育 2h。反应后，加 2 l 2 g/ l的proteinase k在37 c下处理10 min，再将 bp产物（入门载体）加 2l转入大肠杆菌 dh5 ，在含 kan的lb板上筛选，克隆并保存入门载体。lr反应体系(attl x attr attb x attp )入门载体25-50ng 目的载体75ng 5x lr clonase? -

4、buffer 1lte buffer(ph 8.0) or h2o to 4.5 l lr clonase?0.5 ltotal 5 l 体系放于 25 c下温育 2h，反应后，加2 l 2 g/ l的proteinase k 在37 c下处理10 min，再将 2 l反应产物（表达载体）转入大肠杆菌dh5 在含amplb 板上筛选，克隆并保存入门载体。3.质粒提取（安比奥试剂盒说明书）（1） 将含有目的质粒的细菌接种到2-5ml 的 lb 培养基中， 37 度培养 12-16h,取菌液 1.5-6ml 于干净的 1.5mlep管中 10000rpm 1min。（2） 将细菌重悬于 buffe

5、r 250ul pb1 中（已加 rnaase）,窝旋振荡，务必使细菌充分分散。（3） 加入 250ul buffer pb2 ,轻轻颠倒离心管 4-6 次。使溶液充分混允。使溶液澄清，一般反映不要超过5min。（4） 加入 350ul buffer nb3, 轻轻颠倒离心管4-6 次。使溶液充分混允，静置3-5min. （5） 14000rpm离心 10min,将上清转移到含收集管的离心柱内。（6） 1000-12000rpm 离心 1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。（7） 加入 0.5ml 的 buffer pb4 于离心柱内， 1000-12000rpm 离心 1

6、min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。（8） 加入 750ul 的 buffer wb 于离心柱内 , 1000-12000rpm 离心 1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。（9） 重复 8 一次。（10）高速离心（13000-14000rpm）2min, 将离心柱盖子打开在室温下风干5-10min 后置于一干净的1.5ml 的离心管中。（11）加 入 50ul buffer eb 或 者 是 pcr 水 于 离 心柱 的 滤 膜中 央 ， 静置1-3min,10000rpm，1min 则溶液里含有目的质粒。（12）将质粒置于 -20 度保存。注意： b

7、uffer pb1 在用之前必须要加 rnaase ，且要放在 2-8度保存；buffer wb用前必须要加 24ul无水乙醇。4. 大肠杆菌感受态细胞的制备（1） 取出保存于 -80的菌种，用接种针挑取大肠杆菌在lb 琼脂平板上划线，37 培养 12-16h。（2） 挑取一个单菌落接种于20mllb 液体培养基中， 37培养过夜。（3） 按照 1:100的比例取 500 l 菌液接种于含 50mllb 液体培养基的 200m1 三角瓶中，37培养。（4） 其间不断观察菌的状态，待菌生长至对数期中期(od600=0.4-0.6)，约需 3 hr(可在菌液下垫上一本书， 待书中字迹刚模糊时， 即

8、可)， 将菌液转入 50ml无菌离心管中。（5） 在冰上放置 5min， 45000rpm/5min 收集菌体，弃尽培养液。（6） 用预冷的去离子水洗涤沉淀，45000rpm/5min 收集菌体。（7） 沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/lcac12-15%甘油混合溶液，轻轻吹散，冰预 5min，45000rpm/5min 收集菌体。（8） 沉淀加入 2ml 预冷的 0.05 mol/lcacl2-15%甘油，混合溶液，轻轻吹散，即为感受态细胞悬液， 以 120 l 为一份分装于 eppendorf 管中，液氮速冻，存于-80，可保存半年。5. 质粒对大肠杆菌的转化（1） 加入适量连接

9、产物或质粒于120 l 大肠杆菌感受态细胞中混匀， 在冰上放置 20min,使连接产物充分附着在大肠杆菌感受态细胞的壁上。（2） 42热击 50s，立即置于冰上 2 min。（3） 加入 800 l lb 液体培养基，置于37培养箱中，或于37摇床中培养1.5-3h。（4） 6000rpm/2min 收集菌体 ,吸弃 720 l 上清，重悬菌体于剩余的200 llb 液体培养基中 ,将菌液涂布于含相应抗生素的lb 琼脂平板上。（5） 倒置平板， 37培养过夜 (1216h)。6. 农杆菌感受态的制备电击法运用电击法转化农杆菌，可以大大提高农杆菌的转化率，每微克dna 可以得到 1091010转

10、化体，这些参数包括电场强度， 电脉冲长度和 dna 浓度，电压更高或电脉冲更长时， 转化效率将会有所提高， 但由于细胞生存率降低， 转化效率的提高将被抵消。制备用于电穿孔的细胞要比制备感受态细胞更容易的多，细菌生长到对数中期后加以冷却，离心，然后用低盐缓冲液充分清洗以降低细胞悬液的离子强度，用 10%甘油重悬细胞，使其浓度为31010细胞/ml，在于冰上速冻后置于 -80储存，这样，每小份细胞融解后即可用于转化，其有效期至少为6 个月，电转化在低温下 04进行，将 dna 和冷却的细胞悬液混合，然后转移到一个预冷电击槽内，通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱

11、导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（ 50%或更高）的毒性。1.1.2 植物转化农杆菌介导的拟南芥转化浸花法(1)待转化植物材料准备温室土培的拟南芥植株， 待其抽苔 15厘米高时剪去苔的顶端花序， 使腋生花序生长。待植株的待开花蕾数量较多时剪去已经开放的（约在去掉顶端后5-6d)，即可作用转基因材料。(2)农杆菌准备接种阳性农杆菌 gv3101于20mlyeb培养基 (含适当抗生素 )，28 200rpm过夜，然后接种至 200 ml扩大培养，至od600为1.2左右