不同种植物叶中黄酮的提取及比较

1、不同种植物叶中黄酮的提取及比较1 材料与方法（1）材料与仪器。样品：银杏叶、竹叶采自毕节，杜仲采 自织金，均为 2013年 10月份采摘，洗净，烘干，粉碎，备用。试剂：芦丁标准品、 乙醇（无水乙醇） 、氢氧化钠（分析纯） 、 硝酸铝（分析纯）、亚硝酸钠（分析纯）（2）标准曲线的绘制。 取 100 度下干燥之恒重的芦丁 15.26 mg用50%乙醇配制浓度0.50 mg/mL的芦丁标准品，取上述芦 丁标准溶液 0 mL、l mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,分 别转入25 mL容量瓶中，加I mL5%的NaN02 6 min后加入10%1 mLAI（ NO3 3，6 min

2、后加入10 mL 4%NaOf充分振荡摇匀，用 蒸馏水定容至刻度，静置 30 min 后，以芦丁含量为 0.000 mg/mL 的标准溶液为参比，于 500 nm处测定吸光度（Abs），得回归方 程：Y=9.3036X+0.0077，相关系数 R2=0.9992。（3）样品黄酮含量的计算。吸取 5ml 的提取样品至于 25ml 容量瓶中， 按上述绘制芦丁标准曲线的步骤配制提取溶液， 测量 提取液的吸光度A，按下面的公式计算出植物叶黄酮的含量： 黄酮含量式中C一由测得的吸光值代入回归方程计算得到的黄酮浓 度， mg/mLV 一溶液的体积，mL ；为黄酮的百分含量；m为称取样品的质量， g（4）索

3、氏提取法提取不同种植物叶中黄酮类化合物。准确 称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各 5.000 g 于索氏提取仪中，在 70%乙醇，时间2 h，料液比1 : 20的条件下，用100 mL乙醇进 行索氏提取之无色，趁热旋蒸浓缩，后冷冻 12 h ，过柱（活性 炭和氧化铝）除去叶绿素，置于50 mL容量瓶用50%乙醇定容。 按“1.2”方法测定吸光度，并根据标准方程和黄酮含量的计算 公式求出不同植物中黄酮化合物的含量分别为:竹叶0.497%、银杏 0.746% 、杜仲 0.629%。（对比试验）（5）微波提取法提提取不同种植物叶中黄酮类化合物。准 确准确称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各 5.000 g ，

4、加入到圆底 烧瓶中，在70%乙醇，时间50 min，功率400 W,温度70 C的 条件下，用100 mL乙醇进行微波提取，趁热旋蒸浓缩，后冷冻 12 h，过柱（活性炭和氧化铝）除去叶绿素，置于100 mL容量瓶用 50%乙醇定容 4 。按“1.2”方法测定吸光度，并根据标准 方程和黄酮含量的计算公式求出不同植物叶中黄化合物的含量 分别为:竹叶 0.660% 银杏 0.866% 杜仲 1.165%。（对比试验）（6）超声波提取法提取不同种植物叶中黄酮类化合物。准 确称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各 5.000g ，加入到圆底烧瓶 中，用不同的乙醇浓度、超声时间、料液比、超声温度分别进行 单因素影

5、响实验。 为全面考察超声波取法提取不同种植物叶中 黄酮类化合物的影响因素 5 ，在单因素实验的基础上，选取各单因素的最优条件，设计正交实验 L9（ 34），确定植物叶黄酮 的最佳提取条件。2 结果与分析2.1 超声波提取单因素实验（1）乙醇浓度对黄酮提取的影响称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各 5.000 g ，分别用浓度为 30%、 50%、70%、95%的乙醇 溶液在50 °C，料液比（g: mL 1： 20 ,超声波功率50 Hz提 取 30 min ，趁热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用 50% 乙醇稀释定容至 50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与乙醇浓 度之间的关系

6、，实验结果见图 1。图 1 乙醇浓度对黄酮含量的影响由图 1 可知，银杏叶在乙醇浓度为 70%时，总黄酮的含量最 高，之后趋于平缓，因此乙醇浓度为 70%为最佳。竹叶在 70%时， 总黄酮含量最高，之后下降，所以 70%为竹叶最佳的乙醇提取浓 度。杜仲叶在30%- 50%寸黄酮含量呈上升趋势，50%-95%趋于 下降，所以 50%为最佳提取浓度。（ 2）提取寸间对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏叶、杜仲 叶粉末各 5.000 g ，分别以 30 min 、40 min 、50 min 、60 min 的不同提取时间在 50 C，料液比（g： mL ） 1: 20 , 50 Hz超 声波提取。趁热

7、旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用 50%乙 醇稀释定容至 50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与提取时间 之间的关系，实验结果见图 2。图 2 提取时间对黄酮含量的影响由图 2 可以看出，银杏叶在 40 min 时黄酮提取含量值较高， 故最佳提取时间为 40 min 为宜。竹叶在 40 min 黄酮提取含量值 达到最高，往后趋于下降，所以最佳提取时间为 40 min 最佳。 杜仲叶在30 min50 min黄酮提取含量值上升明显，60 min明显下降，故 50 min 为最佳。（3）不同料液比对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏、杜仲 叶粉末各 5.000 g ，分别以 1：16、1：1

8、8、1：20、1：22 的不 同料液比（g: mL ）在50 C , 50 Hz超声波提取30 min。趁 热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用 50%乙醇稀释定容至 50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与料液比之间的关系，实 验结果见图 3。图 3 不同料液比对黄酮含量的影响由图 3 可以看出银杏、竹叶、杜仲在 1： 18 处黄酮含量值达 到最大，往后或趋于平衡或下降， 即在 1： 18 为最佳提取料液比。（4）不同温度比对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏、杜仲 粉末各5.000 g ，分别在40 C、50 C、60 C、70 C下，以 料液比为1: 20 （g: mL ） , 50

9、Hz超声波超声提取30 min。趁 热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用 50%乙醇稀释定容至 50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与温度之间的关系，实验 结果见图 4。图 4 不同温度比对黄酮含量的影响由图 4 可以看出， 银杏叶提取黄酮含量的值随着温度升高而增大，到60 C后趋于平缓，故60 C为最佳提取温度。竹叶在50 C黄酮提取含量最高，往后随温度升高而下降，所以50 C为银杏最佳提取温度。 杜仲黄酮提取含量随温度升高而增大， 在60 C后增大不明显，杜仲的最佳提取温度为60 C70 Co2.2 正交试验设计表1银杏正交实验设计L9 (34)及结果编号 No 因素A 乙醇浓度(

10、 %) B 时间( min) C 料液比( g/mL) D 温度(C)黄酮含量( %)1 50(1)30 (1) 1： 18(1)50(1)1.0132 50(1)40 (2) 1：20(2)60( 2)1.3313 50(1)50 (3) 1：22(3)70( 3)1.3274 70( 2 )30 (1) 1：20(2)70( 3)1.3565 70( 2 )40 (2) 1：22(3)50(1)1.4126 70( 2 )50 (3) 1： 18(1)60( 2)1.4807 95( 3)30 (1) 1：22(3)60( 2)1.4428 95( 3)40 (2) 1： 18(1)70(

11、 3)1.3819 95( 3)50 (3) 1：20(2)50(1)1.397K1 1.224 1.270 1.291 1.274K2 1.416 1.375 1.398 1.355K3 1.300 1.401 1.394 1.418极差( R) 0.192 0.131 0.107 0.144优化方案 A2B3C2D3因素排序 A D B C注：括号内数值为各因素的水平。 从极差分析结果可以得到，影响银杏叶黄酮提取含量的主次 因素为：乙醇浓度 温度超声时间 料液比，最佳提取工艺为 A2B3C2D3即70%乙醇，时间50 min，料液比1 : 20,温度70 C表 2 竹叶正交实验设计 L9（

12、 34）及结果编号 No 因素A乙醇浓度（% B时间（min） C料液比（g/mL） D温度C）黄酮含量（%）1 50（1）30（1） 1:18（1）40（1）1.3752 50（1）40（2） 1:20（2）50（2）1.5423 50（1）50（3） 1:22（3）60（3）1.4624 70（2）30（1） 1:20（2）60（3）1.6255 70（2）40（2） 1:22（3）40（1）1.6056 70（2）50（3） 1:18（1）50（2）1.6637 95（3）30（1） 1:22（3）50（2）1.4828 95（3）40（2） 1:18（1）60（3）1.4739 95（

13、3）50（3） 1:20（2）40（1）1.334K1 1.456 1.494 1.504 1.438K2 1.631 1.540 1.500 1.520K3 1.430 1.486 1.516 1.562极差（R） 0.201 0.054 0.016 0.124优化方案 A2B2C3D3因素排序 A D B C注： 括号内数值为各因素的水平。从极差分析结果可以得到， 影响竹叶黄酮提取含量的主次因 素为：乙醇浓度 温度 超声时间 料液比，最佳提取工艺为 A2B2C3D3 即 70%乙醇，时间 40 min,料液比 1: 22,温度 60 C。表 3 杜仲正交实验设计 L9（ 34）及结果编号

14、No 因素A 乙醇浓度（ %） B 时间（ min） C 料液比（ g/mL） D 温度C）黄酮含量（ %）1 30（1）40 （1） 1： 18（1）50（1）0.8442 30（1）50 （2） 1： 20（2）60（ 2）0.7323 30（1）60 （3） 1： 22（3）70（ 3）0.9614 50（ 2）40 （1） 1： 20（2）70（ 3）1.3735 50（ 2）50 （2） 1： 22（3）50（1）1.3476 50（ 2）60 （3） 1： 18（1）60（ 2）1.2897 70（ 3）40 （1） 1： 22（3）60（ 2）1.1478 70（ 3）50 （2

15、） 1： 18（1）70（ 3）1.2629 70（3） 60（3） 1 ： 20（2） 50（1） 0.912K1 0.8451.121 1.132 1.034K2 1.336 1.114 1.006 1.199K3 1.107 1.054 1.152 1.056极差（R） 0.491 0.067 0.146 0.165优化方案 A2B1C3D2因素排序 A D C B注： 括号内数值为各因素的水平。 从极差分析结果可以得到， 影响杜仲叶黄酮提取含量的主次 因素为：乙醇浓度 温度 超声时间 料液比，最佳提取工艺为 A2B1C3D2即50%乙醇，时间40 min,料液比1: 22,温度60 C

16、2.3 重复性实验 为了验证优化提取条件的可靠性，对银杏叶、竹叶、杜仲叶分别选其上述最优工艺下重复提取 3 次，其总黄酮的平均提取含 量（ %）分别为 1.532、1.847、1.462 ，与前面的微波提取法、 索氏提取法比较，优于两者的提取效果。2.4 提取方法比较 按照研究后的超声优化提取工艺与传统的索氏提取法跟新型的微波提取方法作比较，结果见下表4。表 4 不同提取方法对不同植物提取效果比较项目 黄酮含量（ %）银杏 竹叶 杜仲超声波提取法 1.532 1.847 1.462微波提取法 0.866 0.660 1.165索氏提取法 0.746 0.497 0.629由表可以看出， 按照该研究的优化工艺进行提取较传统的提 取方法提取黄酮的含量高， 不同植物用不同方法所提取的黄酮含 量不同，而不同方法的不同条件对黄酮提取也有很大影