镍柱纯化原理及方法

1、6镍柱亲和层析亲和层析的原理：利用分子间存在特异性的相互作用，它们之间都能够进行专一而 又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。常见具有专一性亲和力的生物分子对：酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 文献将被固定在色谱基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲 和层析的固定相，称为亲和吸附剂。配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体 。 一般载体采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。sss AB 1 -1I山Hc

2、丘c 吃 cNocNHRFigure 1, Interaction between neighboring residues in the 6xHi$ 炀 anc/ Ni-NTA m口仿x.咪唑环：是1, 3二氮杂戊环，英文名是Imidazole,如果在第一位或第三位上的 氮原子上去掉那个氢原子所剩余的部份，就叫咪唑基。就是咪唑上去掉一个和氮 原子直接相连的氢原子后剩下的部分H C-N / HC* CHNH组氨酸的性质：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。金属离子：Cu2+ Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与 N、S和0等供电原子 产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His ）的咪唑

3、基、半胱氨酸（Cys） 的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以 His的咪唑基的结 合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+> Ni2+ > Zn2+Co2+ o镍离子：有六个螯合价位，通常将镍柱分为了 Ni-NTA和Ni-IDA。Ni-NTA螯合了 四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此 Ni-IDA Agarose结合作 用力要比Ni-NTA Agarose强，在同样条件下Ni-IDA Agarose的载量要比Ni-NTA 高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高； 但Ni-NTA更稳定， 不溶性的多孔网状结构，渗透

4、性好； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长; 抗微生物和酶的侵蚀； 最好为粒径均一的球形粒子； 具有亲水性，无非特异性吸附； 含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。例：琼脂糖凝胶微球的商品名为 Sepharose，含糖浓度为2% 4% 6%寸分别称为2B、4B 6B。Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应 用最广。配基：是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子， 能够通过亲和色谱的方式进 行纯化。配基的选择受到两种因素的影响：(1)：配基与目标物的结合必须具有特异性 和可逆。(2)：必须具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不损害它的活性。

5、间隔臂：目标蛋白质的结合位点位于分子中较深的部位，如果将配基直接偶联到基质上，受到空间位阻的影响，配基不能到达目标蛋白的结合位点， 因此与目标 蛋白的结合能力低。于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容 易。间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。间隔臂的长度是关键，太短，无效；太长，发生非特异性结合。一般规则：偶联 的分子量小于1000时使用间隔臂；当大分子量，则不一定要。二硫键：蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成，包内蛋白离开细胞后， 二硫键常以氧化状态存在。此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线

6、状多肽链。上样方式：(1)直接上样 (2)间接上样洗脱方式：(1)pH值洗脱：pH的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程度，使它们结合位点的亲和性降低。(降低 pH的方法)(2) 离子强度洗脱：(3) 竞争性洗脱：(咪唑)再生：(1)先用强变性剂6M盐酸胍冲洗柱子(2) 用水冲洗干净(3) 0.2%SDS冲洗柱子(4) 用水冲洗干净(5) 50%乙醇冲洗柱子(6) 用水冲洗干净(7) 用 100mM EDTA(50mM Tris 100mM EDTA PH 8.0)冲洗柱子(8) 用水冲洗干净(9) 用100mM硫酸镍孵育柱子(10) 20%乙醇中4 C保存上清缓冲液及配方上清纯化

7、缓冲液配方Lysis Buffer50mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 20mM Imidazole; pH8.0;Elution Buffer 150mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 50mM Imidazole; pH8.0;Elution Buffer 250mM Tris-HCl ; 150mM NaCl; 100mM Imidazole ; pH8.0;Elution Buffer 350mM Tris-HCl ; 150mM NaCl; 300mM Imidazole ; pH8.0;包涵体缓冲液及配方包涵体纯化缓冲液配方IB Lysis Buffe

8、r 1IB Lysis Buffer 220mM Tris; 150mM NaCI; 2mM EDTA ; 2mMDTT ;1% Triton X-100; PH8.0;50mM Tris-HCl ; 150mM NaCl ; 8Murea；pH8.0;IB ElutionBuffer150mM Tris-HCl;IB ElutionBuffer250mM Tris-HCl;IB ElutionBuffer350mM Tris-HCl;IB ElutionBuffer450mM Tris-HCl;IB ElutionBuffer550mM Tris-HCl;150mMNaCl ； 20mMlm

9、idazola ； 8Murea； pH8.0;150mMNaCl ； 50mMImidazola ； 8Murea； pH8.0;150mMNaCl ； 100mMImidazola ； 8Murea； pH8.0;150mMNaCl ； 300mMImidazola； 8Murea； pH8.0;150mMNaCl ； 500mMImidazola； 8Murea； pH8.0;试剂及作用I.TritonX -100（曲拉通）：具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来， 达到提取膜蛋白的作用。常用的非离子性去垢剂。用量：1%-3%TritonX -1002. TCEP （三（2-羧乙

10、基）膦）：是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质 化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。 该试剂在水溶液中的稳定性和溶 解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂 如DTT相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联 反应中不需要除掉。用量：1mM/ml.3. Pepstatin（胃蛋白酶抑制剂）：抑制酸性蛋白酶，配置时溶于甲醇中，在水中不 溶解。用量：1ug/ml。 Store at:-4°C（ A week） /-20°C（ Half a year）。4. Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：抑制丝氨酸和巯基蛋白

11、酶，配置时溶于水，用量: 1ug/ml。Store at:-4C（ A week） /-20 C（ Half a year）。5. EDTA （乙二胺四乙酸）：螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑 制作用。不影响蛋白质功能的情况下去除干扰金属离子，但是同时能使金属蛋白酶丧失活性。用量：0.15mmol/L。6.Glycerol（甘油）：增加黏度，减少分子间的碰撞，用量：5%-30%。7.SDS（十二烷基硫酸钠）：能够使蛋白质变性的阴离子型去污剂，用量：0.1%-1%。8.TritonX -114（曲拉通）：温度在22C以上时，在蛋白质溶液中加入 2%的TritonX -114可使蛋白质从去垢剂相和液相中分离， 可溶性蛋白在液相中，而膜蛋白则进 入了去垢相中。（内毒素存在于细胞壁组分，菌裂解后释出物中。）9.DTT （二硫苏糖醇）：常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质 中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或