水产养殖过程中嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性及耐药基因分析

1、水产养殖过程中嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性及耐药基因分析摘要对养殖水体中的嗜水气单胞菌进行选择性别离，分析其对不同抗生素药物的敏感性。采用PCR方法对耐药株的耐药基因gyrA、qnrA和qnrS进行检测。结果说明，嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性最强，这与喹诺酮药物的过度使用密切相关。通过对耐药性嗜水气单胞菌和敏感性嗜水氣单胞菌的耐药基因扩增结果比照，发现耐药基因gyrA的检出率最高。该研究结果可为水产养殖过程中嗜水气单胞菌的耐药性检测及抗生素的合理使用提供分子生物学依据。关键词嗜水气单胞菌;喹诺酮药物;耐药基因;gyrA基因中图分类号S94文献标识码A文章编号0517-661120211

2、7-0083-02doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.023开放科学资源效劳标识码OSID：AbstractTheselectiveisolationwasconductedonAeromonashydrophilainaquaculturewatertoanalyzeitssensitivitytodifferentantibioticdrugs.TheresistantgenesgyrA，qnrAandqnrSweretestedbyPCR.TheresultsshowedthatA.hydrophilawasthemostsensitivetoqui

3、nolones，whichwascloselyrelatedtotheexcessiveuseofquinones.BycomparingtheamplificationresultsofdrugresistantgenesindrugresistantA.hydrophilaandsusceptibleA.hydrophila，itwasfoundthatthedetectionrateofdrugresistantgenegyrAwasthehighest.Theresearchresultscouldprovidemolecularbiologybasisforthedrugresist

4、ancedetectionofA.hydrophilaandrationaluseofantibioticsinaquaculture.KeywordsAeromonashydrophila;Quinolones;Drugresistantgenes;gyrAgene近年来，致病菌正逐渐成为水产养殖的重大危害，成为影响水产产品产量的重要因素。一般采用添加抗生素的方法减轻致病菌的危害。喹诺酮是一类广谱高效的抗菌药物，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较好的抑菌效果，因此喹诺酮药物被广泛应用于水产养殖行业。但由于喹诺酮药物在水产养殖行业中的滥用，许多病原菌对喹诺酮类药物已经产生不同程度的耐药性。因此十分有

5、必要对鱼源病原菌的耐药性进行检测，以便于针对病原菌采用适当的抗生素药物，从而减少致病细菌对鱼类产品健康的危害。笔者首先对发病鱼的致病菌嗜水气单胞菌1-6进行别离，然后对嗜水气单胞菌的药物敏感性进行测试。由于gyrA、qnrA和qnrS基因被认为是嗜水气单胞菌的主要耐药性基因7-10，采用PCR和琼脂糖凝胶电泳分析致病菌中喹诺酮药物抗性基因gyrA、qnrA和qnrS的表达水平，从而为科学水产养殖、合理使用抗生素提供分子生物学依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株。鱼类病原菌嗜水气单胞菌从广东韶关地区水产养殖基地发病的鱼中别离获得。该菌株的鉴定使用梅里埃Vitek-32全自动微生物分析鉴定仪

6、以及全自动菌落计数仪。1.1.2试剂与仪器。细菌浊度计WGZ-2，郑州南北仪器;PCR仪Mastercycle，珠海黑马科技;电泳仪DYY-6C，北京六一仪器厂;凝胶成像系统GE公司。高保真PCRmix购于广州擎科生物科技;Goldview核酸染色剂、10×TAE均购于北京全氏金生物科技;琼脂糖购于invitrogen公司;质粒小量抽提试剂盒购于天根生化科技;柱式细菌基因组抽提试剂盒购于Umagen美基生物科技，广州。1.2方法1.2.1耐药表型检测方法。采用临床实验室标准化委员会CLSI的纸片扩散法NCCLS，2021年测定别离菌的耐药特性，设置培养温度为30，每个培养皿参加药敏纸

7、片，并设置3个平行。以大肠杆菌ATCC25922作为标准质控菌株，用游标卡尺测量抑菌圈直径。病原菌对每种氟喹诺酮类药物的耐药株百分比的计算公式：病原菌对药物的耐药株百分比=耐受菌数之和/总检测病原菌数9。1.2.2耐药基因扩增方法。致病菌模板DNA的制备采用液氮速冻煮沸法提取模板DNA。挑取纯化后的单菌落划线于TSA平板，28下过夜培养，刮取适量菌苔置于含TE的灭菌离心管中，振荡混匀后99金属浴10min，液氮速冻，重复2次，10000r/min离心1min，提取上清液作为PCR扩增的DNA模板10。1.2.3PCR扩增QRDR靶基因。gyrA基因的相应引物序列，由华大基因生物技术合成。gyr

8、A正向引物为CCATGAGCGTGATCGTAGGA，gyrA反向引物为CTTTGGCACGCACATAGACG。PCR反应体系如下：2×TaqMasterMix25L、10mol/mL的上下游引物各2L、DNA模板2L，灭菌双蒸水补足50L。目标基因PCR反应程序如下：95预变性5min;95变性3min，55退火1min，72延伸1min，共30个循环;72延伸5min;以不加DNA模板的作为空白对照，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，使用GE公司的凝胶成像系统观察并拍照，根据目标产物亮度分析耐药基因的表达水平，并对所得PCR产物进行测序鉴定9。2结果与分析2.1细菌药物敏感性

9、采用纸片琼脂扩散法分析了15株致病性嗜水气单胞菌对10种抗生素药物的敏感性，主要是喹诺酮类抗生素药物。其中9株60.0%嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物产生耐药性，致病嗜水气单胞菌对萘啶酸的耐药率最高50.0%，其次是氧氟沙星和诺氟沙星，耐药率分别为23.3%和18.9%;对环丙沙星的耐药率最低，仅7.7%。致病嗜水气单胞菌对头孢类药物呈现不同程度的耐药性，头孢噻吩的耐药率高达90%，而头孢噻肟和头孢曲松的耐药率分别为3.8%和4.2%，这可能与其使用频率有关。致病性嗜水气单胞菌对四环素和多西环素的耐药率较高，分别为35.5%和19.5%。致病性嗜水气单胞菌对青霉素类药物的耐药率较高，如氨苄西林的耐

10、药率高达95.8%，可能由于其使用频率较高;致病性嗜水气单胞菌对氨基糖苷类药物的耐药性呈现较大差异，如对链霉素的耐药率约50%，而对阿米卡星的耐药率只有5.4%表1。2.2喹诺酮基因的PCR扩增根据药物敏感性试验结果，对嗜水气单胞菌标准菌ATCC7966、1株喹诺酮类敏感菌株和6株喹诺酮药物耐药菌株采用PCR方法扩增耐药基因gyrA、qnrB和qnrS基因，耐药株经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察均呈阳性，6株菌中有4株扩增获得604bp左右的qnrB基因图1A，4株均获得610bp左右的qnrS基因图1B，6株菌全部扩增到620bp左右的gyrA基因图1C。然而，标准菌及喹诺酮类敏感菌

11、株未扩增得到目的基因9。3讨论近年来，抗生素在水产行业的应用日趋广泛，通过抗生素的添加可以减少致病菌对水产品的危害，为养殖业减少了经济损失;但随着药物被长期、广泛地应用于水产养殖业中，耐药性细菌也日趋增加。耐药基因一旦被排泄到水产环境中，不仅会对养殖区域和周围的环境造成潜在的基因污染，而且还会通过各种可移动遗传元件如质粒、转座子、整合子等的水平遷移作用进入环境细菌甚至人体中，对人类的健康平安构成潜在的威胁。大量研究说明，在水产养殖过程中嗜水气单胞菌是一种重要的鱼类病原菌，嗜水气单胞菌的耐药性呈增长趋势，并且嗜水气单胞菌主要对喹诺酮药物的耐药性比较常见。为了减少耐药性嗜水气单胞菌对水产品甚至人体

12、健康的危害，十分有必要对养殖水体中嗜水气单胞菌的耐药性及相关耐药基因进行监测，以便于对水产养殖过程中抗生素的使用进行合理标准的管理。该研究中的药物敏感性试验结果说明，嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性最强，这与喹酮药物的过度使用密切相关。通过对耐药性嗜水气单胞菌和敏感性嗜水气单胞菌的耐药基因扩增结果比照，发现耐药基因gyrA的检出率最高，说明该基因对嗜水气单胞菌的耐药性十分重要，是喹诺酮药物耐药性的关键基因。这与以前关于耐喹诺酮药物耐药基因的研究结果根本一致7-10。嗜水气单胞菌的gyrA基因编码DNA旋转酶，作用于喹诺酮药物，使其不能发挥药效，从而产生耐药性。该研究中关于水产养殖过程中嗜水气单

13、胞菌药物敏感性及其耐药基因检测结果可为水产养殖过程中抗生素的合理使用提供理论依据，从而促进当地水产养殖业的良性开展。参考文献【1】张翠娟，于宙亮，赵宝华，等.嗜水气单胞菌研究进展J.中国兽药杂志，2021，427：46-50.【2】陆承平.致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述J.水产学报，1992，163：282-288.【3】周碧君，李永明，温贵兰，等.斑点叉尾鮰致病性嗜水气单胞菌的别离J.水产科学，2021，2312：9-12.【4】文正常，余波，徐景娥，等.患病大鲵中嗜水气单孢菌的别离鉴定及其防治J.基因组学与应用生物学，2021，291：82-86.【5】张玉芬，张秀军，张文丽，等.鲤鱼嗜水气单胞菌的别离与鉴定J.安徽农业科学，2021，3631：13689-13690，13709.【6】王昱，袁增壮，聂福平，等.孟加拉进口黄鳝中致病性嗜水气单胞菌的别离与鉴定J.安徽农业科学，2021，4124：9997-9999，10026.【7】朱健铭，姜如金，吴康乐，等.从耐药产气肠杆菌中首次发现DNA旋转酶A亚单位基