可降解塑料的生物合成实用教案

1、第一节 可降解塑料概述 石化工业的兴起，使得石油化工合成塑料在人类生活中扮演着重要的角色，7070年代以来(yli)(yli)，塑料工业得到迅猛的发展，无论工业、农业、建筑业、还是人们的日常生活，无不与塑料密切相关。 但目前所使用的化学合成塑料在自然环境中很难分解，也不会被腐蚀，燃烧处理又会产生有害气体，越来越多的塑料垃圾却对环境造成巨大的危害。 第1页/共57页第一页，共58页。 普 通 塑 料 是 以 合 成 树 脂 为 主 的 化 学 合 成 材 料(cilio)(cilio)。对环境污染具有以下特点： 污染范围广，江河湖泊、田野山川无处不有。 污染物增长量快。 据统计，全世界每年对塑料

2、的需求量为1 1亿吨，倾入海洋的塑料垃圾达数1010万吨，陆上的更是难以计数。 1985 1985年我国农用薄膜为3030万吨，19901990年为5050万吨，20052005年，中国包装用塑料需求量达到了500500万吨，按30%30%为难以收集的一次性塑料包装材料(cilio)(cilio)和制品计算，则废弃物产生量达150150万吨。我国可覆盖地膜的面积为5 5亿多亩，需求量已达到100100万。第2页/共57页第二页，共58页。 处理难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性。埋地里处理百年(binin)(binin)不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如HClHCl、SOxSOx、

3、COCO等。 各种塑料及相近制品在环境中被预期降解的时间制 品 自动售 铝罐 聚乙烯泡 可处置(chzh) 木制筷子 塑料瓶 货机杯 沫杯/盘 尿布 （PET）时间/a 20 100 500 20 20 100 回收利用难。塑料制品种类多，填料、颜料多样，难以分拣回收再利用。 生态环境危害大。地膜降低耕地(gng(gngd)d)质量，农作物植株矮小，抗病力差；残膜随风飘动，对周围环境、畜牧业、养殖业都有很大的影响第3页/共57页第三页，共58页。 数量如此巨大的塑料垃圾对生态和环境产生了严重的影响，由此引发的环境问题将日益严重。许多国家已开始用生物可降解塑料代替部分石油化工合成塑料，并陆续颁布

4、了一些法规，禁用某些塑料制品。 如意大利已立法规定自19911991年起所有包装用塑料都必须生物可降解，我国也开始禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。 当前，生产降解塑料的国家主要有美国(mi u)(mi u)、意大利、德国、加拿大、日本、中国等。第4页/共57页第四页，共58页。 美国是开发降解塑料的主要国家之一，主要有十几家单位，如塑料降解研究联合体（PDRCPDRC）、生物/ /环境降解塑料研究会（BEOPSBEOPS）等，其宗旨在于进行有关降解材料合成、加工工艺、降解试验、测试技术和方法标准体系的建立。 近年日本相继(xingj)(xingj)成立了生物降解塑料研究会、生物降解塑料实

5、用化检讨委员会，日本通产省已将生物降解塑料作为继金属材料、无机材料、高分子材料之后的“第四类新材料”。 欧洲Bhre-EuraeBhre-Eurae更是对生物降解塑料建立了完善的降解评价体系。第5页/共57页第五页，共58页。 生物降解塑料是指在自然环境下通过微生物的生命活动能很快降解的高分子材料。按其降解特性可分为完全(wnqun)(wnqun)生物降解塑料和生物破坏性塑料。按其来源则可分为天然高分子材料、微生物合成材料、化学合成材料、掺混型材料等。 天然高分子型是利用淀粉、纤维素、甲壳质、蛋白质等天然高分子材料制备的生物降解材料。这类物质来源丰富，可完全(wnqun)(wnqun)生物降解

6、，而且产物安全无毒性，日益受到重视。 美国Warner-LambertWarner-Lambert公司开发了由70%70%支链淀粉和30%30%直链淀粉制成的新型树脂，有良好的生物降解性，可替代农业上使用的各种生物降解材料。第6页/共57页第六页，共58页。 在众多的生物可降解材料中，采用微生物发酵法生产的聚-羟基烷酸（简称PHAsPHAs），成为应用环境生物学方面的一个研究的热点。其中，-羟基丁酸（简称PHBPHB）及3-3-羟基丁酸与3-3-羟基戊酸的共聚物 简称P(3HB-co-3HV)P(3HB-co-3HV)或PHBVPHBV是PHAsPHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。 聚-

7、羟基烷酸（PHAsPHAs）作为(zuwi)(zuwi)一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射性等外，更重要的是它还具有生物可降解性和生物可相容性。第7页/共57页第七页，共58页。 已有研究表明，采用PHAsPHAs制作的香波瓶，在自然环境中9 9个月后，可基本上被完全降解，而同样用合成塑料制作的物品，完全降解时间约需100100年。因此，研究 和 开 发 聚 - - 羟 基 烷 酸 （ P H A sP H A s ） ， 使 之 成 为(chngwi)(chngwi)同类用途的石化合成塑料最有潜在的替代品，可避免或减少塑料废物对环境的污染，

8、具有深远的环境意义。第8页/共57页第八页，共58页。第二节第二节 PHAs PHAs的结构、物理化学性质的结构、物理化学性质(xngzh)(xngzh)和应用和应用 O CH CH2 C nORR R为甲基时，单体(dn t)(dn t)为-羟基丁（HBHB）；R R为乙基时，单体(dn t)(dn t)为-羟基戊酸（HVHV）；R R为丙基时，单体(dn t)(dn t)为-羟基己酸（HCHC）；R R为丁基时，单体(dn t)(dn t)为-羟基庚酸（HHHH）； n n为单体的数目。 R R为甲基时，其聚合物为-羟基(qingj)(qingj)丁酸（PHBPHB） ， R R为乙基时，

9、其聚合物为-羟基(qingj)(qingj)戊酸（PHVPHV）；其他依次类推。PHAs的通式可写成：第9页/共57页第九页，共58页。 多种微生物在一定条件下能在细胞内积累聚-羟基烷酸（PHAsPHAs）作为碳源和能源的贮存物。 我们采用溶剂法从不同细菌中可以提取这些多聚物，有些多聚物的相对分子质量可高达2 2106106。 每个PHAPHA颗粒含有(hn yu)(hn yu)数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质和机械性能如韧度、脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。 例如3-3-羟基丁酸与3-3-羟基戊酸的（PHBVPHBV）共聚物中-羟基戊酸组分的增加可使熔点从

10、180oC180oC（PHBPHB）降至75oC75oC。第10页/共57页第十页，共58页。 多数有关细菌聚-羟基烷酸（PHAsPHAs）的物理化学性质的研究是针对-羟基丁酸（PHBPHB）及3-3-羟基丁酸与3-3-羟基戊酸的共聚物（PHBVPHBV）两种聚合物进行的。 PHB PHB是高度结晶的晶体，其物理性质以及(yj)(yj)分子结构上与聚丙烯（PPPP）很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张强度等，而PHBPHB具有相对密度大、透氧率低和抗紫外线照射以及(yj)(yj)具有光学活性、阻湿性和压电性等优点。 聚-羟基烷酸（PHAsPHAs）的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑

11、料所不具备的。PHAsPHAs这类热塑性聚酯能纺丝、压膜或注塑，在工业上可用作各类包装材料等，在医药方面的应用由于有生物相容性的特点，可作外科缝线、骨骼代用品或骨板，手术后无需取出。 第11页/共57页第十一页，共58页。 研究还发现PHB的降解产物D(-)-3-羟基丁酸是所有高等动物中的一种普遍存在的中间产物，在原核生物和真核生物中发现的含有100-200个单体的小分子量PHB，具有作为细胞膜离子通道组成的作用，并且在人体的血浆中也检测到它的大量存在。所以，植入哺乳动物组织的-羟基丁酸（PHB）不会对机体产生毒性。 表8-2-2 PHAs的应用 应用范围 PHAs的应用 外科缝线、肘钉、拭子

12、等；伤口敷 料；血管替代品；骨骼替代品和骨 医药上 板（由于压电效应能促进骨骼生长(shngzhng)）； 长效药物的生物降解载体 长效除莠剂、抗真菌剂、杀虫剂； 肥料等的生物降解载体；容器、瓶、 工业上 袋、薄膜等包装材料；妇女卫生用品、 尿布等；合成手性化合物的前体原料第12页/共57页第十二页，共58页。第三节第三节 PHAs PHAs的生物的生物(shngw)(shngw)合成合成一、合成PHAsPHAs的主要(zhyo)(zhyo)微生物二、合成PHAsPHAs的主要(zhyo)(zhyo)基质三、 PHAs PHAs的代谢途径与调控第13页/共57页第十三页，共58页。一、合成一、

13、合成(hchng)PHAs(hchng)PHAs的主要微生物的主要微生物 能产生(chnshng)(chnshng)聚-羟基烷酸（PHAsPHAs）微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌，计6565个属中的近300300种微生物。 目前研究较多的用于合成PHAsPHAs的微生物有：产碱杆菌属，假单胞菌属，甲基营养菌，固氮菌属和红螺菌属等。它们能分别利用不同的碳源产生(chnshng)(chnshng)不同的PHAsPHAs。 在多数情况下微生物能利用糖加丙酸或戊酸产生(chnshng)PHBV(chnshng)PHBV的，并可通过改变两者的配比控制共聚物中HBHB和HVHV的比例。但丙酸或

14、戊酸价格高，且对细菌有毒，因而在培养液中的浓度必须控制很低，产率及转化率都不高，这些也是生产上的不利因素。第14页/共57页第十四页，共58页。 上个世纪90年代以来发现，在分类上属于红球菌属、诺卡氏菌属和棒杆菌属中的一些菌能利用葡萄糖或其他单一碳源产生含HB和HV的PHA。 上个世纪末，有人观察到真养产碱杆菌H16的异亮氨酸缺陷型突变株R8能从单一的无关连碳源例如果糖或葡萄糖酸等产生PHBV。以果糖为碳源时，共聚物占细胞干重的47%。 这些发现不仅给PHA生物合成和调节机制的研究增加了新的内容，而且对探索从廉价的单一碳源生产PHBV方面(fngmin)开辟了一条新的途径。 第15页/共57页

15、第十五页，共58页。 选择工业生产PHAs的菌种可以考虑以下几个因素(yn s)，主要包括细菌能利用廉价碳源的能力、生长速率、多聚物合成速率和能在细胞内最大积累多聚物的程度。 如英国ICI公司分别对固氮菌、甲基营养菌和真氧产碱杆菌进行了考察： 首先，放弃了固氮菌、因为这类菌还会产生多糖，从而降低了-羟基丁酸（PHB）的产率。 其次，否定了甲基营养菌，这类菌的PHB产率不高，胞内PHB含量仅为65%左右。 第三，舍去了甲醇，虽然甲醇的价格低，但转化系数也低， 经考察，最终选择了真养产碱杆菌作为PHAs的生产菌株，因为该菌株生长快、易培养、胞内PHB含量高、聚合物的分子量大以及能利用各种较经济的碳

16、源。第16页/共57页第十六页，共58页。二、合成二、合成PHAsPHAs的主要基质的主要基质 1. 1.糖质碳源糖质碳源 可用来工业化生产可用来工业化生产PHAPHA的糖质碳源有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等。的糖质碳源有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等。 （1 1）葡萄糖）葡萄糖 真养产碱杆菌野生株真养产碱杆菌野生株H16H16利用果糖积累利用果糖积累PHBPHB，其利用葡萄糖的，其利用葡萄糖的变异株已用于工业生产变异株已用于工业生产PHBPHB。 如凯姆等人采用细胞密度培养的方法，通过在线葡萄糖浓度的控制，首先如凯姆等人采用细胞密度培养的方法，通过在线葡萄糖浓度的控制，首先(shuxin)(shu

17、xin)使菌体平衡生长至使菌体平衡生长至70g/L70g/L，再让其积累，再让其积累PHBPHB，50h50h细胞浓度达细胞浓度达164g/L164g/L，干细胞中，干细胞中PHBPHB含含76%76%，发酵液中含量为，发酵液中含量为121g/L121g/L，PHBPHB的生产强度为的生产强度为2.42g/2.42g/（ Lh Lh ），是目前世界上已报道的最高记录。），是目前世界上已报道的最高记录。 第17页/共57页第十七页，共58页。（2 2）蔗糖及糖蜜 肥大产碱杆菌能利用蔗糖积累-羟基丁酸（PHBPHB），采用分批补料培养的方法积累的PHBPHB量达60 g/L60 g/L以上，目前已

18、中试生产的水平为15m315m3反应器每周生产1tPHB1tPHB。该菌的特点是生长较快，能利用廉价的甜菜或甘蔗糖蜜，并且细胞生长与PHBPHB的积累同步。 但是，使用糖蜜作基质还很有争议。培格认为，用甜菜糖蜜作基质其价格是葡萄糖的1/21/2，而ICIICI公司认为糖本身虽然价格较低，但杂质多，增加了PHBPHB积累的难度，为了提高PHBPHB含量，糖蜜原料需精制，这就增加了成本。另外，使用糖蜜还会给后提取增加困难（如粘度大，需脱色等），糖蜜系季节性产品(chnpn)(chnpn)，储运不易，再有糖蜜含糖量较低（通常含糖50%50%以下），如用来作细胞的高密度培养还需补加纯糖，这也会影响成本

19、，所以从使用糖蜜的总效益综合考虑，尽管糖蜜本身廉价，用于实际生产上仍有许多困难需要克服。第18页/共57页第十八页，共58页。 2. 2.甲醇 甲醇是最便宜的基质之一，但由于甲醇菌积累PHBPHB含量不高，加大了PHBPHB回收过程的成本，而且PHBPHB的分子量较小，故ICIICI公司放弃了这条路线。 但由于甲醇价格低，仍然吸引人们寻求新的菌种和开发更有效的培养方法。 凯姆等使用嗜有机甲基杆菌，在微机辅助的自动补料分批培养系统中，在限钾的条件下（25mg/L25mg/L）大量生产PHBPHB，甲醇浓度维持(wich)(wich)在2-3g/L2-3g/L时不抑制细胞的生长，培养70h70h细

20、胞浓度高达250g/L250g/L，是当今高密度培养产PHBPHB细胞浓度的最高记录。 第19页/共57页第十九页，共58页。 3 3气体H2/CO2/O2H2/CO2/O2 真养产碱杆菌等一些(yxi)(yxi)爆鸣气细菌能利用H2/CO2/O2H2/CO2/O2产生-羟基丁酸（PHBPHB），其中H2H2作为能源，CO2CO2是碳源。 H2 H2是一种干净的可再生资源。通过同化CO2CO2生产生物降解塑料，可以同时解决温室效应及废弃的非降解塑料的危害等两个严重的环境污染问题。但在技术上要解决混合气体爆鸣的安全问题和气体的循环利用问题。 控制基质气相中氧的浓度低于气体爆炸的下限（6.9%6.

21、9%）是安全的，而循环气体的闭路培养体系能有效地利用气体。 田中等人研究了真养产碱杆菌利用H2/CO2/O2 H2/CO2/O2 的高密度培养产PHBPHB的最新结果是，在限氧条件下培养40h40h，细胞浓度和PHBPHB浓度分别达到91.3g/L91.3g/L和61.9g/L61.9g/L。第20页/共57页第二十页，共58页。 4 4烷烃及其衍生物 假单胞菌能利用中等(zhngdng)(zhngdng)链长的烷烃或其衍生物醇、酸等产生中等(zhngdng)(zhngdng)链长羟基烷酸的共聚物（PHAMCLPHAMCL），而共聚物中单体的组成与基质碳架的长度有关。 以辛烷作基质连续培养食油

22、假单胞菌，通过优化培养基和增加氧的转移率，稳定态细胞浓度增至11.6 g/L11.6 g/L，用传氧很有效的反应器作分批补料培养，38h38h细胞浓度为37.1 g/L37.1 g/L， PHA PHA占细胞干重的33%33%。 如通纯氧以适应细胞对氧的需要、用辛酸分批补料培养45h45h，细胞浓度为41.8 g/L41.8 g/L， PHA PHA占细胞干重的37.1%37.1%。第21页/共57页第二十一页，共58页。三、PHAs PHAs 的代谢途径与调控 研究表明，许多微生物在碳源过量而其他(qt)(qt)某种营养成分，如氮、磷、镁或氧不足时，能在细胞内大量积累聚-羟基烷酸，以作为碳源

23、和能源的贮存物。 当限制性营养物再次被提供时，PHAs PHAs 能被细胞内酶降解后作为碳源和能源利用。 细胞中积累的PHAsPHAs以单个粒子的形态存在，不同微生物细胞含有的颗粒数量及颗粒大小不同。 在真养产碱杆菌中，每个细胞含有810810个颗粒，每个颗粒直径大小为0.20.5m0.20.5m。 在电子显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性，颗粒外面包裹着一层膜，该膜没有生物膜那样的典型双层结构，膜中含有PHAsPHAs合成酶的降解酶系统。 第22页/共57页第二十二页，共58页。 PHAs PHAs除在微生物饥饿条件下作为碳源和能源外，还为微生物在其他环境压力条件下（如渗透压、脱水或紫

24、外线照射）的生存起着重要的作用。 一般说来，在恶劣环境下含有PHAsPHAs的细胞微生物比不含PHAsPHAs的细胞具有更高的存活率。 最近研究发现，PHAsPHAs除了作为细胞内贮物的生理作用外，还是细胞膜的结构化合物。 不同(b tn)(b tn)微生物合成PHAsPHAs的途径不同(b tn)(b tn)，基质不同(b tn)(b tn)，其合成途径也有差异，这是微生物代谢多样性的一种表现。第23页/共57页第二十三页，共58页。 在不同微生物中，利用不同基质合成PHA的主要途径(tjng)包括： （1）真养产碱杆菌及多数细菌利用糖作为基质合成PHB; （2）深红红螺菌利用糖作为基质合成

25、PHB; （3）食油假单胞菌等利用中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHA； （4）一株产碱杆菌利用长链偶碳数脂肪酸合成PHB; （5）铜绿假单胞菌等利用糖质碳源合成具有中链HA单位的PHA; （6）真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV。 第24页/共57页第二十四页，共58页。在真养产碱杆菌以及许多微生物中，PHB PHB 是从已酰CoACoA通过三步反应合成。 一是由生物合成的-酮基硫酯酶催化两个已酰CoACoA的cccc结合； 二是由依赖NADPHNADPH的已酰已酰CoACoA还原酶催化产生D(-)3-D(-)3-羟基(qingj)(qingj)丁酰CoA CoA ；

26、三是由PHBPHB聚合酶将D(-)3-D(-)3-羟基(qingj)(qingj)丁酰CoACoA连接到PHB PHB 正在增长的链上。第25页/共57页第二十五页，共58页。第四节第四节 PHAs PHAs的发酵的发酵(f (f jio)jio)生产生产一、 PHAs PHAs的流加发酵二、 PHB PHB发酵过程(guchng)(guchng)中理论产率的计算第26页/共57页第二十六页，共58页。一、 PHAs PHAs的流加发酵 阻碍聚-羟基烷酸（PHAsPHAs）实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本问题。影响PHAsPHAs生产成本的主要因素有菌种、原料、操作方式以及提取方法等。

27、 所以，降低PHAsPHAs的生产成本主要考虑以下几点： 其一，采用廉价基质（如CO2CO2、H2H2和O2O2或甲醇、乙醇(y chn)(y chn)、葡萄糖及来自农业废物的有机酸等）和提高最终产物对基质的产率系数，以降低发酵原材料的成本。 其二，提高生产强度（如选育高产菌株，采用合适的发酵生产方式等），以降低操作成本。 其三，改进提取、纯化技术（如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化操作等），以降低提取成本。第27页/共57页第二十七页，共58页。 除上述3点外，还应采用适宜的发酵生产方式，这是提高聚合物的生产率和改进其质量的关键。 现代发酵工业中，绝大多数的培养均采用纯种液体培养方法，液体培养

28、的操作方法主要有间歇（分批）培养、连续培养和流加培养3种。 细胞的分批培养是一种(y zhn)间歇培养方式。在培养时，培养系统除了需不断进行通气和加入酸碱溶液以及排出废气外，与外界没有其他的物料交换。在分批培养中，细胞浓度、基质浓度和产物浓度均不断发生变化。第28页/共57页第二十八页，共58页。 连续培养的方法是将新鲜的培养基连续地加入有均匀培养液的反应器中，同时排出发酵液，使培养环境如底物浓度、产物浓度、细胞浓度、比生长速率等可不随时间变化而变化，保持培养的稳定状态。在连续培养中，任何一种营养成分都可以用作限制性底物。 所谓(suwi)流加培养，又称半连续发酵，是指在培养过程中不断向反应器

29、内加入培养基，但不同时取出培养液的培养方法。它是一种介于分批培养和连续培养之间的培养方法。兼有两者的优点，而又克服了两者的缺点。和传统的分批培养相比，流加培养可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻遏等；与连续培养相比，流加培养的染菌可能性小，也不易产生菌种老化变异等。第29页/共57页第二十九页，共58页。 所谓限制性底物，是指在培养微生物的营养物质中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。 由于许多微生物只有在氮、磷或氧等缺乏而碳源过量的不平衡生长条件(tiojin)下才能大量积累PHAs，所以在PHAs的发酵生产中，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行控制： 第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶

30、段微生物利用基质形成大量菌体，而多聚体PHAs的积累量很少； 第二阶段为多聚体形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。第30页/共57页第三十页，共58页。 在简单分批培养过程中，当菌体生长进行到一定浓度时，培养基中一种或几种营养物质的浓度可能成为菌体细胞进一步繁殖的限制因素，而简单地增加该种营养物质的初始浓度不可能导致菌体生长量的相应增加，相反某些成分在较高浓度时对细胞会产生毒害作用，另一些还可能形成沉淀，因而采用分批发酵法不能获得很高的细胞干重(n zhn)以及高的产物浓度和生产强度。 而采用流加发酵法进行PHAs的生产时，就可以在某些必需的营养成分成为生长限制因素之前，

31、对其进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而可获得较高的菌体浓度。 第31页/共57页第三十一页，共58页。 （一） 采用流加培养法生产PHBPHB 在实际应用中，通常选择限制培养基中的氮源作为流加控制(kngzh)(kngzh)的手段，因为微生物的生长对氮源的依赖比对其他离子更强，微生物对氮源的同化作用也比其他离子更快。 研究发现，在流加培养过程中，控制(kngzh)(kngzh)恰当的碳氮比相当重要。为什么？ 在PHB PHB 合成阶段开始时，采用较低的碳氮比可以保持细胞具有较高的PHBPHB合成能力，随着胞内PHB PHB 含量的增加，微生物细胞的PHBPHB合成能力下降，这时可逐渐增加

32、培养基中的碳氮比。 第32页/共57页第三十二页，共58页。 在流加培养过程中，可以通过在线检测尾气中CO2浓度，来间接估计胞内PHB含量，达到适时控制培养过程中碳氮比的目的(md)。 真氧产碱杆菌A.eutrophus是到目前为止对其动力学和代谢途径研究得较为透彻的、也是唯一已用于工业过程来生产多聚体的一类微生物，此菌能利用多种基质如葡萄糖、果糖、乙酸、丁酸或H2、O2和CO2的混合气体等来合成PHB。第33页/共57页第三十三页，共58页。 通过对真氧产碱杆菌其生长过程的动力学研究发现，在菌体生长阶段和PHBPHB形成阶段之间存在一短暂的过度阶段，此过程阶段在氮源耗尽的同时形成，仅维持不到

33、一个世代时间，此时，残留菌体和蛋白质的形成速率降为零，并且它们的含量在随后的时间内保持恒定，而PHBPHB的形成速率迅速达到最大值，随后逐渐(zhjin)(zhjin)下降至最终为零。 很明显，在以氮源为限制条件的PHBPHB形成过程中，限量添加氮源能促进PHBPHB的积累，这些结果与前面提到的用甲基营养菌合成PHBPHB的情况相一致，在PHBPHB形成阶段维持很低浓度的氮源时， PHB PHB的形成速率比不加氮源的情况要高。第34页/共57页第三十四页，共58页。（二） 采用流加培养法生产共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV） 由3-3-羟基丁酸和3-3-羟基戊酸聚合而成的共聚物P

34、 P（HB-co-HVHB-co-HV） 是瓦尔恩等人在19741974年从活性污泥的絮凝物中分离出的第一个共聚物，也是目前最具工业前景和吸引力的共聚物。 在共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的生产过程中，流加发酵操作比分批发酵具有明显优势。为什么？ 丙酸或戊酸是生产共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV） 所必需的基质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性，采用流加培养法，可避免由于培养基中有机酸的积累(jli)(jli)而使细胞活力受到损害，从而达到提高P P（HB-co-HVHB-co-HV） 产率的目的。 第35页/共57页第三十五页，共58页。 除3-3-羟基

35、丁酸外，现在已知有4040多种不同的脂肪酸可作为PHAsPHAs的组成成分。 最近的研究发现，大多数能积累PHBPHB的微生物也具有积累共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的能力，而且各种微生物从有机酸合成共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的途径和对有机酸的耐受能力也各不相同。 由于所用的合成共聚物的基质(j zh)(j zh)（如丙酸或戊酸）价格相对较昂贵，如果丙酸在代谢过程中转向产能或形成乙酰CoACoA，进而形成HBHB单体，将会使共聚物中HVHV单体的含量下降而导致生产成本的增加。第36页/共57页第三十六页，共58页。 除丙酸和戊酸能被作为生产共聚物P（HB

36、-co-HV）的基质外，最近得到的由真氧产碱杆菌A.eutrophus 异亮氨酸缺陷型突变株自发转变成的光养株R3，能从单一的如葡萄糖或果糖等无关联碳源产生共聚物P（HB-co-HV）。 例如以果糖为碳源时，共聚物占细胞干重的47%， HV单体含量7%，这些发现，一方面给PHAs生物合成和调节机制的研究(ynji)增加了新的内容，同时，也开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产共聚物P（HB-co-HV）的新路。 第37页/共57页第三十七页，共58页。（三）流加培养条件对多聚体相对分子质量分布的影响 多聚体的相对分子质量常常影响其质量和生物降解的速率。 一般平均相对分子质量大且相对分子质量分布范围

37、窄的多聚体具有更广泛的工业应用前景，并且提取也较方便，而对于某些(mu xi)(mu xi)特殊用途，相对分子质量不宜超过1 1105105。 多聚体的平均相对分子质量大小受流加培养条件的影响。当培养条件恒定时，其平均相对分子质量也可以保持恒定，因而只要控制适宜的流加培养条件，就可将其相对分子质量控制在所需的范围之内。第38页/共57页第三十八页，共58页。 苏祖凯等人对假单胞菌属的微生物以甲醇为基质合成PHB时的培养条件（如温度、pH、甲醇浓度等）进行了研究。 发现温度会影响PHB的形成速率和含量(hnling)，但对其聚合度没有影响； pH值对聚合物平均相对分子质量的影响很小； 在流加培养

38、过程中，甲醇浓度对多聚体平均相对分子质量的大小有显著影响。 当甲醇浓度很低（如0.5g/L）时，其平均相对分子质量可达8105，当甲醇浓度很高（如32g/L）时，其平均相对分子质量小于0.5 105 。第39页/共57页第三十九页，共58页。 除采用改变流加培养中基质浓度的方法来改变聚合物的相对分子质量大小外，另一个方法是利用细胞内PHB 的不平衡降解来改变其相对分子质量分布。 细胞积累多聚体是为其在恶劣环境下生存所用，因而，如果在培养过程中的某一阶段仅添加氮源而不加碳源，PHB就会被细胞降解，作为能源加以利用，而且(r qi)，低分子量聚合物的降解速率大于高分子量聚合物的降解速率。 这可使P

39、HB的平均相对分子质量转换至较高的值。 为了获得更均质的共聚体，在共聚物P（HB-co-HV）的积累阶段开始时，应先使培养物处于碳源饥饿状态，这样可使细胞内源PHB的量大大降低，得到的共聚物P（HB-co-HV）就较为均一。第40页/共57页第四十页，共58页。二、 PHB PHB发酵过程中理论产率的计算 PHB PHB是仅有C C、H H和O O元素组成的多聚物，在合成PHBPHB所需的基质中，碳源的消耗量最大，所占发酵原料成本的比例也最大，因而，产物PHBPHB对碳源的产率Yp/cYp/c，是影响PHBPHB工业化规模生产的重要因素。 PHB PHB发酵过程的理论产率和总产率： 从简单的数

40、学角度考虑很容易推断，在假定没有非PHBPHB部分(b fen)(b fen)的残留菌体合成时，产物PHBPHB对碳源的产率Yp/cYp/c，可达到最大值，该最大值被命名为PHBPHB对碳源的理论产率Yp/cYp/c； 当考虑到在平衡生长阶段形成菌体所消耗的碳源时，该实际产率Y1p/cY1p/c，称为总产率。第41页/共57页第四十一页，共58页。 通常有两种不同的方法来计算理论产率，即化学计算法和生化(shn hu)计算法。 在生化(shn hu)计算法中，必须仔细考虑合成PHB过程的代谢途径和辅酶的再循环过程。 在大多数细菌中， PHB是从乙酰CoA经3个连续的反应而形成的，这三个反应分别

41、被3-酮基硫解酶、依赖于NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶和PHB合成酶所催化。 必须注意到乙酰乙酰CoA还原酶是与NADPH相关连的，即该酶仅催化下列反应： 乙酰-CoA + NADPH + H+ D-3-羟基丁酰CoA + NADP+ （1式）第42页/共57页第四十二页，共58页。 尽管在PHB合成途径的3个反应(fnyng)中，即不需要NAD+也不需要ATP，但必须考虑包括PHB生物合成途径在内的所有途径中NAD+/NADH和ATP/ADP的再循环，这些辅助基质的缺乏不可能使代谢中间产物顺利流动。 NADP+通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶再生，细胞内PHB合成的净反应(fnyng)如下： 葡萄

42、糖+（3p+1）ADP+（ 3p+1 ）Pi+（3/2）O2 （1/n）PHB+2CO2+3H2O+（ 3p+1 ）ATP （2式） 式中p是P/O比率，从该反应(fnyng)式中可以计算出PHB对基质葡萄糖的理论产率为：YP/C =86/180 = 0.48第43页/共57页第四十三页，共58页。 总的产率是从实际发酵过程中计算出来的，PHB在细胞生长停止后积累或部分在细胞生长的同时积累。 假定所消耗的总碳量（-St），分成(fn chn)两部分，合成PHB所耗部分为（-S1），合成非PHB的菌体所消耗的部分为（-S2），则有： （-St）= （-S1）+ （-S2） （3式）第44页/共5

43、7页第四十四页，共58页。第五节 PHAs PHAs的提取技术 PHB PHB的提取技术主要涉及到两个问题： 一是方法的合理性，主要表现在提取率、产物的纯度，提取过程是否对PHB PHB 的结构产生影响，从实验室到工业生产放大(fngd)(fngd)的可行性，以及操作是否方便，预、后处理是否复杂，环境污染程度等。 二是过程的经济性，表现在提取所用材料费用、能量消耗以及设备投资等。 由于PHB PHB 以颗粒状态存在于细胞中，分离提取比较困难，所以，探索PHB PHB 的提取方法以降低提取成本具有十分重要的意义。第45页/共57页第四十五页，共58页。一、有机溶剂法 有机溶剂包括：氯仿、二氯乙烷

44、、1,1,2-1,1,2-三氯乙烷、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯(bn x)(bn x)酯等。 其基本原理是，这些有机溶剂一方面能改变细胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHBPHB溶解到溶剂中，而非PHBPHB的细胞物质不能溶解，从而将PHBPHB与其他物质分离开来。 第46页/共57页第四十六页，共58页。 用有机溶剂的方法进行提取得到的 PHB纯度可达到很高，但存在以下(yxi)缺点： （1）当溶剂中含有超过50g/L的PHB时，溶液变得很粘，要去掉细胞的残余物很困难； （2）即使经过多次反复提取，仍有一定量的PHB存在于菌体中，所以提取率难以达到很高； （3）使用大量的有机溶剂，尽管溶剂可回收再用

45、，但仍造成巨大的原料消耗； （4）大量有毒、易爆、挥发溶剂的使用，对环境造成严重污染，给操作带来不便。 第47页/共57页第四十七页，共58页。二、次氯酸钠法 次氯酸钠能够破胞，而且对细胞中的非PHBPHB的细胞物质的消化很有效。用该方法具有破胞所得产品的纯度较高、提取速度快等优点。但由于次氯酸钠对PHBPHB分子有严重的降解作用，因此所获得的PHBPHB分子量小。 为了克服其缺点(qudin)(qudin)，哈恩等人结合氯仿提取时PHBPHB纯度高，而且被降解程度小的特点，发明了用分散的次氯酸钠/ /氯仿提取PHBPHB的方法。 次氯酸钠/ /氯仿的方法比单纯使用氯仿提取率高，比单纯使用次氯

46、酸钠分子量大。但此方法仍然需要使用大量有机溶剂，并且操作比较复杂，所以限制了其在工业上的应用。第48页/共57页第四十八页，共58页。三、酶 法 酶法提取PHBPHB的原理与次氯酸钠法类似，即让大量的非PHBPHB的细胞物质溶解，而PHBPHB不溶解，从而(cng r)(cng r)达到分离、提纯的目的。 由于非PHBPHB的细胞物质通常包括蛋白质等大分子物质，实际上是通过多种酶的协同作用来达到消化非PHBPHB的细胞物质。 单纯使用酶来消化细胞中的杂质成分，所得PHBPHB的纯度不高，需结合其他的方法，如再用表面活性剂处理，可得到较高纯度的PHBPHB。 酶法提取PHBPHB，其提取成本较高

47、、处理过程较复杂，在实际应用中仍然受到很大限制。第49页/共57页第四十九页，共58页。四、表面活性剂/ /次氯酸钠法 为了克服酶法提取PHBPHB存在的操作步骤多以及酶作用条件苛刻的不足，同时为了尽量避免使用有机溶剂而用水相体系提取PHBPHB，人们研究了用表面活性剂/ /次氯酸钠法提取PHBPHB。 用这种方法提取PHBPHB的原理，有人(yu rn)(yu rn)认为，在低浓度时，表面活性剂单个分子进入到细胞膜的磷脂双层中；随着表面活性剂浓度的增加，更多表面活性剂分子结合到磷脂双层中，表面活性剂与磷脂形成大量的胶团，胞内物质PHBPHB释放出来。表面活性剂的另一个作用是，通过对蛋白质的变

48、性、增溶作用，使细胞膜更易被破坏。 使用表面活性剂/ /次氯酸钠的方法，能够比较方便地实现在水相中提取PHBPHB，但要使用较大量的表面活性剂，而且次氯酸钠的使用不可避免地造成了PHBPHB的降解。第50页/共57页第五十页，共58页。五、其他(qt)(qt)方法 近年来随着基因工程技术的进步，人们开发了用重组大肠杆菌生产PHBPHB的方法，用氨水从这类细胞中提取PHBPHB是其中的一种方法。 该法是基于碱性条件下氢氧根离子通过皂化作用溶解了细胞中的脂类物质，从而使得PHBPHB释放出来。 氨水提取法成本较低，而且比上述所有方法在操作上都方便，但它提取所得的PHBPHB的纯度不是很高，即使与其他(qt)(qt)方法相结合，提取的PHBPHB的纯度仍然只在90%90%左右。 上个世纪末，无锡轻工大学研制出了一项成本低、操作简便、环境污染小的PHBPHB提取新工艺，所申请的专利已公开。第51页/共57页第五十一页，共