脂质体制备方法

1、微脂体(又称脂质体)及其制备方法微脂体(又称脂质体)微脂体起源于I960年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐 分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；1968年，Sessa和 Weissmann等人正式将此小球状的物体命名为微脂体(liposome)并做出明确的定义：指 出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer)所组成的微小的囊泡，有自行密合 (self-closin©的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶 液形成，由于构造的特性，可同时作 为厌水性(hydrophobic)及亲水性(hydrop hi 1 ic)药品的载体，厌

2、水性药品可以嵌入脂双 层中，而亲水性药品则可包覆在微 脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜 为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对 向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形 成是两性物质 在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂 体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正 电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度 (transition temperature, Tc),影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度 越高

3、，双键数越多则临界温度越低,常见的DPPC(dipalmitoylphosphatidylcho line) 与 DSPC(distearoylphosphatidylcholin 的临界温度分别是 42° C 与 56° C,而 Eg g PC (egg phosphatidylcholine 与 POPC (palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine的Tc则低于OC。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密 度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；止匕外，当外界温度处于临界温度时，微脂体 脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不

4、一致而使微脂体表面产生裂缝，造 成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增 加微脂 体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加 微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类：(1) Multilamellar vesicle(MLV )是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm,特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，直接水合后， 即形成MLV ,体积通常较为庞大，脂质含量较高。MLV的脂双层 数，一般在五层以上； 小于五层的 MLV 又称为 ol

5、igo-lamellar liposomes 或 pau cilamellar vesicle。(2) Large Unilamellar Vesicle ( LUV)则是单层脂双层所构成的微脂体，一般指1000 nm等级(250-2500 nm或更大)的微脂体，动物细胞便是一种LUV。(3) Intermediate-sizedUni lame liar Vesicle (IUV)也是单层脂双层所构成的微脂 体，一般指100 run等级(25-250 nm)的微脂体。不过，目前一般文献已经很少 使用 IUV ,而是将它并入SUV中。(4)Small Unilamellar Vesicle (

6、SUV)是单层脂双层所构成的小微脂体,早期的分类指特定磷酸脂所能够成的最小微脂体(一般以超音波震荡制成)o如egg PC以生理食盐水(normal saline)水合的 SUV 是 15 nm； DPPC 则是 25 nmo制备微脂体最传统的方法是薄膜摇振法。如今已经发展出非常多种制备微脂体的方法，包括：1 .)薄膜摇振法(Thin film method; Han d-shaki ng method)：又称做 Ba ngham, s method,将脂质以有机溶剂如氯仿(chloroform)、甲醇(methano)及乙醇(e thanol)等溶解，均匀混合后，利用旋转真空干燥机(rotar

7、y evaporator)使圆底瓶 内的溶剂挥发之后，即可在瓶壁上形成均匀的脂质膜，在临界温度以上的温度条件下， 将欲包覆物质的水溶液和脂质膜混合，用手左右摇动，将瓶壁上的脂质膜振下来，脂质 在水溶液中即会自动形成MLV o2 .)冷冻一再解冻(freez-thaw)均质(homogenization及超音波震荡法(sonication method):禾U用微脂体破裂后会再自行密合的特性，以机械性的力量均质或超音波震荡的方式，或者多次冷冻、再解冻的方式，造成微脂体的破裂及重组再密 合，最 后可形成大小较均匀的单层微脂体。3 .)反相蒸发法(Reverse phase evaporation

8、method)：以有机溶剂溶解高浓度 的 脂质，快速混入对于脂质量而言体积极少的药品水溶液，将两者混合均匀后再以旋转真空 干燥机使有机溶剂挥发，形成包覆率较高的微脂体。这种方法适合用来包覆较为稀少或 是较珍贵的药品及蛋白质。4 .)有机溶剂注射法(solvent injection)和清洁剂透析法(detergent dialysis) 禾U用有机溶剂和清洁剂溶解脂质，与准备包覆的水溶液混合形成微脂体后，以透析法 除去有机溶剂和清洁剂。5 .)滤膜挤出法(Extrusion )：可将上述方法制成的微脂体，改变成所需粒径大小 的单层微脂体。MLV或LUV置于挤压器(extruder中，加热到临界

9、温度以上的温度，以氮 气或氮气加压，即能将粒径较大的微脂体挤成接近滤膜孔径大小的微脂体。重复挤压数次 后，即可制造出所需粒径大小且粒径分布范围相当窄的微 脂体。禾用这种方法制成的微脂 体可将粒径大小控制到一百奈米以下。微脂粒在体内之举止，依其本身的型态、粒径、脂质组成、表面电荷及服用者 的生理状 况、投药部位等而有很大差异。微脂粒于静脉注射后，在血液中至少与两类血浆蛋白发 生作用，1)所谓调理素(opsonins可附着于微脂粒表面，促使其被RES之吞食细胞噬食。2)高密度脂蛋白(HDL )袭击微脂粒，藉phosphat idylcholi ne tran sferas&舌性蛋白之助，抽

10、掉微脂粒上之磷脂分子，使微脂粒破洞 或崩溃，内容物漏出。此二作用皆导致微脂粒在体内之半减期缩短。目前已研究出几种 改善之道以延长微脂粒在血液循环中之半减期，此种微脂粒称为长命微脂粒(stealth liposomes)。微脂粒的表面可设法接上抗体或受质，在体内发挥指向功能。针对目标细胞膜上的 特殊抗原或受体，将对应抗体或受质分子接在微脂粒上，可使绝大部份的微脂粒聚集至 目标细胞。微脂粒与细胞作用的机制有数种：1)膜组成交换(intermembrane transfer)： 即微脂粒膜的组成与细胞膜的组成中有一部份互相交换；2)吸着(adsorption)：微脂粒附着于细胞膜；3)膜融合(fus

11、ion)：微脂粒与细胞膜融合，将包容物送 进细胞内； 4)吞食(phagocytosis, endocytosis :微脂粒被细胞吞食。欲使微脂 粒依期望之机制与 细胞作用，则要设计微脂粒。阳离子脂质体(cationic liposome)介导转染核酸进入真核细胞的方法是从80年 代中期发展起来的一种最具创新性的、高效的转染(transfection)技术。阳性脂质体 (cationic liposome),又称阳离子脂质体、正电荷脂质体(positively charged lipo some),是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。它可作为荷负电物质的传递载体，特别适用于蛋白质、多肽和寡核甘酸类

12、物质、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(R NA)等， 所以在基因治疗方面有独特应用，近年来，成为在体外研究基因功能和基因表达调控机理的重要手段。阳性脂质体介导的转染法可将外源基因导入任意 种类哺乳 动物的原代细胞或连续培养的细胞，在贴壁培养体系和悬浮培养体系中均能应用，并且能 得至I顺时表达(transient expression和稳定表达(stable expr ession的细胞株。1 .阳性脂质体的组成 绝大多数阳性脂质体是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组 成。中性磷脂和阳性成分都是具有亲水和疏水两种基团，其分子间相互间隔定向排列形 成类脂双分子层。其中，中性磷脂起到稳定双层膜和

13、降低阳性成分毒性的作用，同时提供 阳性脂质的细胞渗透功能。阳性成分是具有不同化学结构的两性分子，多为双链季镂盐 型表面活性剂，为整个脂质体提供正电荷，有很强的细胞膜去稳定化作用。目前，使用最广泛的阳性成分有以N-l- （2, 3-二油酰氧基）丙基卜N,N,N-三甲基氯化镂（DOTMA）、3 （- N- （ N / , N / -二甲基胺乙基）胺基甲酰基胆固醇（DC- Choi）、2 , 3二油酰氧-N-2 （精胺陵基酰胺）乙基-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸镂（D0SPA）、1 ,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基澳化镂（D0TAP）等，具有体外稳定性好，体 内可被生物降解的特点，但具有

14、一定的细胞毒性。2.阳性脂质体介导基因转染的作用机制阳性脂质体介导的基因转染过程中，阳性脂质体 的重要性体现在三个方面：（1）与DNA形成脂质体-DNA复合物（2）与细胞膜的作 用（3）将DNA释放到细胞中。2. 1阳性脂质体-DNA复合物（Lipoplex）的形成最初人们认为，阳性脂质体的表面带正电荷，能被核酸中带负电荷的磷酸根所吸附，这样通过阳性脂质体的介导，可以把核酸物质结合到细胞膜上。Gershon于1993年使用电镜技术，研究了复合物的形成和结构特征。他认为，阳性脂质体最初结合到 DNA分子上，在核酸分子上形成成束的囊泡聚合物。当聚合达到一定程度 时,DNA诱导的 脂质体膜融合和脂质

15、体诱导的DNA断裂同时发生，断裂后的DNA分子被包封于重新形成的脂质体中。后来，Stefan Huebner等于1999年系统地阐述了复合物的结构特征及形成机理。他指出，复合物的形成与脂质体/ DNA的电荷比例有密切联系。复合物有三种形式：（1）由DNA包裹的单层囊泡（2）由单层囊泡组成的寡聚复合物（3）多层囊泡聚合物。并且他提出“脂质体滚动”：当 一个由DNA包裹的单层囊泡被另一个“模板”囊泡吸附，随即发生断裂，沿着“模板” 囊泡“滚动”，依此类推，就形成了多层囊泡聚合物，这就解释了复 合物缺口形成的原 因。目前，这一观点已逐渐为广大研究者所认可。2. 2细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取

16、最初的研究指出，最初的研究指出，对于带负电荷的核酸物质(DNA、RNA和寡核营 酸)，主要是通过胞饮作用(endocytosis进入靶细胞的。通过细胞内吞作用(e ndocytosis)，将复合物包封于有衣小泡(coated vesicle)内。进入细胞质后，有 衣小泡 形成内吞小泡(endosome)与其它细胞内囊泡融合，又将内吞物转送到溶酶体(lyso me)内，实现内吞作用介导的脂质体与细胞的融合。还有一种假说是融合理论： 阳性脂质体与细胞结合后，脂质体膜和细胞膜表面重合部分发生融合，将DNA释放到胞 浆中。Wrobel等曾以肝癌细胞G2 (Hep G2)和中国仓鼠卵巢(CH0)细胞为

17、靶细胞，研 究了脂质体与细胞的融合过程，证明内吞作用是融合的关键。在三磷酸 腺甘(ATP)耗 竭剂和高渗介质等抑制内吞作用的物质存在下，脂质体只能与细胞 表面结合，不能实现内 吞作用，而此时转染效率较无抑制剂的对照组相比低了许多。Leventis等发现阳离子脂 质体与细胞融合活性和转染率不一致，证明融合机制不是其转运的主要渠道。所以，人们 认为细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取 主要通过内吞作用来实现的。2. 3阳性脂质体-DNA复合物(Lipoplex)在细胞内释放DNA的机制Hopkins等指出阳离脂质体-DNA复合物进入细胞内与溶酶体(lysome)膜融合，主要 分布于核周高度有序的管

18、状结构中，如核内体(endosome)中，含有阳离子脂质体-DNA 复合物的核内体膜极不稳定，可以释放出复合物。Farhood等在研究中也发现溶菌酶试剂 氯醛的存在会抑制DNA向细胞的传递过程，因此，认为脂质体的主要功能是使内吞小泡去 稳定化，将DNA释放到细胞中。3影响阳性脂质体介导的基因转染效率的因素3. 1阳性脂质体与DNA的电荷比例Huebner 等应用冷冻蚀刻电镜技术（cryo and freeze-fracture electronic microscopy）发现，阳性脂质体与DNA的电荷比例决定了复合物的结构和大小，电荷比 例有0.2的差距，其复合物的结构、大小都有很大差异。不加

19、DNA的情况下，脂质体是 单层囊泡（unilamellar vesicles形式存在，其直径为65nm （土 18nm） o当DNA的比例较少时，复合物多以多层囊泡聚合物（multilamellar complex）形式存在，其直径较单层囊泡要大的多。当DNA的比例较高时，复合物多以DNA包被的单层 囊泡（DNA-coated, and fused DNA-coated, unilamellar vesicles 结构存 在，也有 少量寡聚复合物（cluster of DNA-coated vesicle,其大小较多层囊泡 聚合物小的多。 不同类型的细胞其吸收大小各异颗粒的能力也不尽相同。根据

20、具体情况准备适宜的脂质体 -DNA复合物对于转染效率是很重要的。3. 2细胞的状态维持转染细胞的生长是重要的，但更重要的是细胞要处于健康旺盛状态。常规的细胞操 作是包括分瓶的传代（passage ,每次传代以1： 3至口 1： 5的比例分瓶，具体的传代间 隔时间以细胞的生长周期来决定。同时转染时机的把握也很重 要一般，细胞铺满瓶底50% 。70%为宜，注意在转染时培养瓶内细胞不能长 满。3.3 血清血清中的载脂蛋白与脂质体的相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低，双 分子层堆积特性改变和脂质从脂质体转移到载脂蛋白上，使脂质体膜的通透性增加，最 终破裂。其次血清白蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋

21、白也可引起脂质体膜的不稳定。 DNA -脂质体复合物同细胞通常是在无血清环境下作用的，如果部分转染要在一定百分比 的血清浓度下才能完成，但脂质体-DNA复合物仍必须在无血清的条件下形成。若在脂 质体-DNA复合物形成过程中血清存在的话将会降低转染的表达活力，这可能是由于复 合物同带负电荷的血清蛋白结合，电荷被中和的缘故，但当脂质体-DNA复合一旦形 成，影响就不那么明显。3.4 载体在实施转染的过程中，选择适合的转染载体如同选择恰当的细胞株和培养条件一样重 要。载体包括质粒、通常认为的嵌合体、杂交细菌或杂交细胞，有时也包括病毒序列。完 成转染过程后，一些基因顺序允许载体在细菌（如普通的大肠杆菌

22、）中复制以增殖足 够量的DNA;另外的一些序列则是在真核细胞中克隆化的转基因表达所必需的。一类载体 能在真核细胞内成指数倍复制，最终导致细胞死亡，它们只能用于暂时性的表达；另 一类不在真核细胞内复制的载体可同时应用于暂时的和稳定的表达。使用自发性复制的质 粒，在真核细胞中允许非指数复制，这就可能不通过整合作用而得到稳定的表达。3. 5阳性脂质体的阳性成分许多研究表明，阳性脂质体的阳性成分对于基因的转染率有很大影响。Claire等以 几种不同的阳性脂质体介导质粒DNA pSV-CAT转染3T3脂肪细胞，以氯霉素乙酰基转 移酶（CAT）活性代表转染率，结果表明转染率依次为:LipofectAMIN

23、E > DOGS > DOTAP >Lipofectino Che ng等以阳性脂质体-DNA-转铁蛋白介导3半乳 糖甘酶基因转染人宫颈癌上皮细胞（Hela）,转染相对有效性为DC-Chol> LipofectAMINEo 由 Pinnaduwage 等合成的 DTAB , TTAB , CTAB 介导的基 因转染 率低于 Lipofectino4.阳性脂质体介导转染法的优点及应用前景阳性脂质体作为一种高效的基因传递载体， 具有下列优点：可防止核酸被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中。无毒、无免疫原性,具有生物惰性, 可生物降解。易于制备，使用方便，可将大的DNA

24、片断转运到细胞中。基因转染率 高，离体细胞可以瞬间表达外源基因。目前，阳性脂质体介导转染技术在基因治疗方面取 得巨大的成果，随着转染机制的阐明，这一全新的技术在今后的基因治疗领域中将发挥 其无穷的潜力。制作方法一二：(1)Lipids and lipid vesiclesEgg-phosphatidyl-choline(egg-PC), dipalmitoyl-phosphatidylcholine (DPPC), dimyris toy1-phosphatidyl-choline (DMPC) and cholesterol (Choi) were obtained from Avan ti

25、 Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) and stored in chloroform. All lipids were use d without further purification. High graded mica was purchased from Ted Pella, I nc.(Redding, CA). Pure water was obtained with a MilliQ system (Millipore, Befo rd, MA). One of methods for preparing supported bilayers

26、is by fusion of vesicle s. Large unilamellar vesicles (LUV) were prepared by the freeze-thaw extrusion m ethod. The lipids, dissolved in choloform, were dried to a thin film under a strea m of nitrogen, and were dried overnight in vacuum for the solvent to completely evaporate. The lipid film was th

27、en hydrated and mixed by vortex. After six free ze-thaw cycles the suspensionwas passed through the lores of a polycarbonated membrane (200nm, Avanti Polar Lipids Inc.) with the aid of a lipid extruder (Av anti Polar Lipids Inc. ). Vesicle solutions were made in aqueous solution and then diluted to

28、the desired concentration in a lOmM MgC12 solution.(2)ILS MethodAnother method for preparing supported bi layers in the experiment is by deposit! ng two monolayers onto mica substrate. The first monolayer is deposited by inve rse-LS method 6. Mica, which have a hydrophilic surface, was submerged just bel ow the subphasesurface before t